Impact of colchicine on experimental Coxsackievirus B3-induced myocarditis

Abstract

Background - The nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor pyrin domain-containing-3 (NLRP3) inflammasome, activating the proteolytic cleavage from pro-IL-1β and pro-IL-18 into their active forms IL-1β and IL-18, is an important mediator in the pathogenesis of Coxsackievirus B3 (CVB3)-induced myocarditis. The anti-inflammatory drug colchicine, which is traditionally used to treat gout, exerts its effects, among others, via reducing NLRP3 activity, and has been shown to improve several cardiac diseases including pericarditis. The aim of the present study was to evaluate the potential of colchicine to improve experimental CVB3-induced myocarditis. Methods and results - In vitro, HL-1 cells were infected with CVB3 at a multiplication of infection (m.o.i.) of 2 in serum starvation medium (s.s.), or incubated with s.s. for 1 hour (h). Afterwards, HL-1 cells were stimulated with 100ng/mL colchicine or PBS for 4 or 24h, followed by flow cytometry analysis. Colchicine declined the CVB3-induced percentage (%) of apoptotic cells, and the expression of the Coxsackie- and adenovirus receptor 24h post-infection, by 1.4-fold (p<0.0001) and 1.4-fold (p<0.001), respectively. Furthermore, colchicine decreased the CVB3-induced NLRP3 activity 4h post-infection, as obviated by 1.3-fold (p<0.005), 1.2-fold (p=0.001), and 2.0-fold (p<0.0001) lower ASC-, caspase 1-, and IL-1β-expressing cells in CVB3+colchicine versus CVB3-infected HL-1, respectively. In vivo, C57BL6/j mice were intraperitoneally injected with 1x105 plaque forming units of CVB3 or with PBS on day 0. Twenty-four h later, mice were treated with colchicine (5μmol/kg BW) or PBS via oral gavage. Mice were hemodynamically characterized at day 7 and subsequently sacrificed. Colchicine improved left ventricular (LV) function in CVB3-infected mice. This was associated with a 1.9-fold (p<0.01) and 4.6-fold (p<0.001) lower LV Col1a1 and LOX mRNA expression in CVB3+colchicine mice versus untreated CVB3-infected mice, whereas the CVB3-induced collagen I / III protein ratio was not decreased in CVB3+colchicine versus CVB3 mice. Colchicine damped the CVB3-induced % of splenic CD68+ monocytes and LV presence of CD68+ monocytes by 1.1-fold (p<0.01) and 2.3-fold (p<0.005), respectively, which was paralleled by 1.4-fold (p<0.05) and 2.1-fold (p<0.05) lower Ly6C and TNF-α LV mRNA expression, respectively. Colchicine further decreased the % of ASC-, caspase 1-, and IL-1β-expressing cells in the heart of CVB3-infected mice. A 4.7-fold (p<0.01) lower LV CVB3 mRNA expression was observed in CVB3+colchicine versus CVB3 mice. Conclusions - Colchicine improved cardiac function in CVB3-induced myocarditis in C57BL6/j mice, involving reduction of cardiac NLRP3 inflammasome activity.

Hintergrund Das nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor pyrin domain-containing-3 (NLRP3) Inflammasom, aktiviert die proteolytische Spaltung von pro-Interleukin (IL)-1β in seine aktive Form IL-1β und ist ein wichtiger Mediator in der Pathogenese der Coxsackievirus B3 (CVB3)-induzierten Myokarditis. Das entzündungshemmende Medikament Kolchizin, welches traditionell zur Behandlung von Gicht eingesetzt wird, übt seine Wirkung unter anderem durch die Reduzierung der NLRP3-Aktivität aus und es wurde gezeigt, dass es verschiedene Herzerkrankungen, einschließlich der Perikarditis, verbessert. Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von Kolchizin auf die CVB3-induzierten Myokarditis zu evaluieren. Methoden und Ergebnisse In vitro wurden HL-1 Zellen mit einer Multiplikation der Infektion (m.o.i.) von 2 in serumfreien Medium (s.s) oder nur mit s.s. für 1 Stunde (h) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 100 ng/mL Kolchizin oder PBS für 4 oder 24h stimuliert, gefolgt von der durchflusszytometrischen Analyse. Es zeigte sich, dass Kolchizin den CVB3-induzierten Anteil an apoptotischen Zellen (in %) bzw. den Anteil an Coxsackievirus-Adenovirus-Rezeptor (CAR)-exprimierende Zellen um das 1,4-fache (p<0,0001) bzw. das 1,4-fache (p<0,001) senkt. Des Weiteren reduzierte Kolchizin die CVB3-induzierte NLRP3-Aktivität 4h nach der Infektion gegenüber den unbehandelten Zellen, was sich in einer 1,3-fachen (p<0.005), 1,2-fachen (p=0.001) und 2,0-fachen (p<0.0001) Abnahme an apoptosis-associated speck-like protein-containing protein (ASC)-, Caspase 1- und IL-1β-exprimierenden Zellen zeigte. Für die in vivo Untersuchungen wurden C57BL6/j Mäuse an Tag 0 mit 1x105 plaque forming units CVB3 in PBS oder PBS intraperitoneal injiziert. Vierundzwanzig h später wurden die Mäuse entweder mit 5μmol/kg Körpergewicht Kolchizin oder PBS mittels Schlundsonde behandelt. An Tag 7 erfolgte die hämodynamische Charakterisierung und anschließende Opferung der Tiere. Hierbei zeigte sich, dass Kolchizin die linksventrikuläre (LV) Funktion der CVB3-infizierten Mäuse verbesserte. Dies war mit einer 1,9-fach (p<0.01) und 4,6-fach (p<0.001) geringeren Genexpression von Col1a1 und LOX, jedoch nicht mit einer Änderung der Kollagen I/III Proteinratio, im LV der CVB3+Kolchizin Tiere gegenüber den CVB3 Tieren verbunden. Des Weiteren, verminderte Kolchizin den CVB3-vermittelten Anstieg an CD68+ Monozyten in der Milz und die Zunahmen von CD68+ Monozyten im Herzen um das 1,1-fache (p<0.01) bzw. das 2,3-fache (p<0.005). Parallel dazu, war die kardiale Genexpression von Ly6C und tumor necrosis factor (TNF)-α in den CVB3-Tieren um das 1,4-fache (p<0.05) bzw. das 2,1-fache (p<0.05) geringer nach Applikation von Kolchizin als nach PBS. Weiterhin reduzierte Kolchizin den Anteil von ASC-, Caspase 1- und IL-1β-exprimierenden Zellen im Herzen von CVB3-infizierten Tieren. Schlussfolgerung Kolchizin verbesserte die LV Funktion im Model der CVB3-induzierten Myokarditis, welche die Reduzierung der NLRP3-Aktivität beinhaltet.