Molecular Characterization of Optic Atrophy Protein OPA1

Abstract

The mitochondrion is an essential cytoplasmic organelle that provides most of the energy necessary for a eukaryotic cell. Mitochondrial structure and functions are maintained by proteins of both mitochondrial and nuclear origin. The entire mitochondrial population is in constant flux, driven by continual fusion and division of mitochondria. Defects in mitochondrial dynamics can cause deficits in mitochondrial respiration, morphology and motility leading to apoptosis under extreme conditions. Mutations in OPA1, a nuclear encoded mitochondrial protein, involved in the mitochondrial fusion mechanism cause autosomal dominant optic atrophy. OPA1 is expressed as eight mRNA splice variants in human cells generated by alternative splicing of exons 4, 4b and 5b (Delettre et al., 2001). This study was undertaken to characterize the mouse OPA1 GTPase. Four mRNA splice variants 1, 5, 7 and 8, were found in mouse tissues generated by alternative splicing of exons 4b and 5b. In contrast to an earlier report, alternative splicing of exon 4 was not confirmed. While the overall level of OPA1 gene transcription seems to be constant throughout tissues, the individual expression level of the four splice variants in the mouse brain differs when compared to other tissues, indicating the existence of a post-transcriptional regulatory mechanism. Particularly, splice form 1 was predominantly expressed in the mouse brain. To study the expression of OPA1 protein isoforms, monoclonal antibodies were generated that identified six protein isoforms on western blots. Mass spectrometry and N-terminal microsequencing revealed the two longest forms to be OPA1 isoforms 1 and 7 which are cleaved by mitochondrial processing peptidase (MPP) during protein import into mitochondria. Furthermore, post-MPP processing by other unknown proteases in regions corresponding to exons 5, 5b and 6 generated three different short forms of OPA1. Only the long forms were tightly embedded into the mitochondrial inner membrane, whereas the short forms were extracted easily from the membranes presumably due to the loss of the transmembrane domain after post-MPP processing. The expression levels of OPA1 protein isoforms varied in a tissue dependent manner, though all the tissues contained identical set of isoforms. OPA1 isoform 1 was predominant in mouse nervous tissues. Gel filtration experiments showed that the longest of the three short forms distinctly formed a dimer of 184-kDa while all other OPA1 protein isoforms were part of a 285-kDa complex. The two coiled-coil domains present in the OPA1 protein isoforms showed a high affinity to self- associate (but not to hetero-associate) that likely mediated the complex formation. Yeast Two-Hybrid screens, co-immunoprecipitation and size exclusion chromatography experiments failed to identify proteins interacting with OPA1.

Mitochondrien sind essentielle, cytoplasmatische Organelle, die den Hauptanteil der Energie generieren, den eine eukaryontischen Zelle benötigt. Die Struktur und Funktion der Mitochondrien wird durch mitochondrial- und kernkodierte Proteine aufrechterhalten. Die gesamte Mitochondrienpopulation einer Zelle befindet sichin einem konstanten Flux, der durch permanente Fusions- und Teilungsvorgänge dieser Organellen in Gang gehalten wird. Defekte in dieser Dynamik können Defizite in der Respiration, Morphologie und Beweglichkeit der Mitochondrien verursachen, die im Extremfall sogar zur Apoptose führen. Mutationen in OPA1, einem kernkodierten mitochondrialen Protein, welches in mitochondriale Fusionsprozesse involviert ist, können der Grund zur Ausprägung einer autosomal dominant erblichen Optikusatrophie sein. Die Expression des OPA1 Gens resultiert in 8 verschiedenen Spleissvarianten in humanen Zellen, die durch alternatives Spleissing der Exons 4, 4b und 5b entstehen (Delettre et al., 2001). Die vorliegende Studie befasst sich mit der Charakterisierung der OPA1 GTPase aus der Maus. Vier mRNA Spleissvarianten (1, 5, 7 und 8) wurden in Mausgewebe nachgewiesen, die durch alternatives Spleissing der Exons 4b und 5b entstehen. Im Gegensatz zu der oben genannten Veröffentlichung, wurde alternatives Spleissing von Exon 4 nicht bestätigt. Obwohl der generelle Level an OPA1 Gentranskription in vielen Geweben konstant zu sein scheint, unterscheidet sich das individuelle Expressionsniveau der 4 verschiedenen Spleissvarianten im Maushirn von den Niveaus in anderen Geweben. Dieser Befund deutet auf die Existenz eines post-transkriptionellen Regulationsmecha-nismusses hin. Eine besonders starke Expression der Spleissform 1 im Maushirn wurde festgestellt. Um die Expression von OPA1 Proteinisoformen studieren zu können, wurden monoklonale Antikörper hergestellt, die 6 verschiedene Proteinisoformen im western blot identifizierten. Massenspektroskopische Analysen und N-terminale Mikrosequenzie-rung zeigten, das es sich bei den beiden grössten OPA1 Formen um die OPA1 Isoformen 1 und 7 handelt, die durch die Mitochondriale Prozessierungspeptidase (MPP) während des mitochondrialen Proteinimports gespalten werden. Post-MPP Prozessierungsvor-gänge, die durch bisher unbekannte Proteasen in den Regionen ausgeführt werden, die von den Exons 5, 5b und 6 kodiert werden, lassen drei verschiedene kurze Formen von OPA1 entstehen. Diese kurzen Formen können leicht von mitochondrialen Membranen extrahiert werden, da sie ihre Transmembrandomäne nach der Post-MPP- Prozessierung verloren haben. Nur die langen OPA1 Polypeptide sind stabil in der inneren Mitochondrienmembran verankert. Obwohl die Expressionsnivieaus der OPA1 Proteinisoformen gewebespezifisch variieren, enthalten alle ii Zusammenfassung Gewebe das gleiche Set an Isoformen. Isoform1 war auch auf Proteinebene im Nervengewebe der Maus am stärksten exprimiert. Gelfiltrationsexperimente zeigten, dass die grösste der drei kurzen Formen einen Dimer von 184-kDa Grösse bildet, während alle anderen OPA1 Isoformen Teil eines 285-kDa Komplexes waren. Zwei Coiled-coil-Domänen des OPA1 Proteins zeigten eine hohe Affinität für Homo-Assoziation, gingen aber keine Hetero- Interaktionen ein. Sie tragen sehr wahrscheinlich zu der Komplexformation der OPA1 Moleküle bei.