Thermo-Responsive Nanogels as Versatile Platform for Smart Drug Delivery Systems and Multi-Functional Photothermal Agents

Abstract

Nano-sized smart drug delivery agents such as responsive nanogels evolved as promising carrier systems for therapeutic actives. With a targeted delivery of their cargos, they improve pharmacokinetic profiles of the drugs and thus provide the potential to overcome dose limits, and reduce the occurrence of toxic side effects. However, the complexity of the occurring diseases and the huge variability of possible therapeutic actives, ranging from small molecules to therapeutic proteins, make it essential to adjust the carriers to the specific requirements. This work addresses that need by identification of key parameters to control the properties and structure of responsive nanogels and develop adaption concepts to broaden the range of cargo therapeutics and extend the field of applications. In a comprehensive investigation of reaction kinetics and nanogel formation under various conditions, key parameters to control the properties of thermo-responsive nanogels could be elucidated. Using this knowledge, the network density, size, and swelling ability of the nanogels could be adjusted for efficient encapsulation of proteins. The use of the thermo-responsive polymer poly-N-isopropyl methacrylamide (PNIPMAM) beside poly-N-isopropyl acrylamide (PNIPAM) allowed a precise tuning of the volume phase transition temperature (VPTT) of the resulting nanogels in the range between 34 – 47 °C. For all nanogels, a temperature triggered release of the encapsulated proteins was demonstrated in vitro. The delivery of the proteins into viable skin layers could be confirmed using ex vivo skin. The tuning of the temperature-response of the nanogels allowed the use of external heat sources to trigger dermal protein delivery in high efficiency and under temporal and local control. Next, the adjustment of the assessed nanogels for mucosal delivery of anti-inflammatory drugs was targeted. Therefore, the crosslinker was modified incorporating disulfides which should endow the nanogels to interact with mucus and thus overcome its clearance mechanisms. Using the reductive cleavage of the disulfides into thiols, studies of the degradation profiles of resulting nanogels could be used as a proof for the successful incorporation of disulfides in PNIPMAM based nanogels. In contrast, the use of PNIPAM alone or as a copolymer with PNIPMAM resulted in no or only partly degradation of the resulting nanogels indicating a premature cleavage of the disulfides during nanogel formation. Studies on the interaction with mucus and the penetration into freshly excised porcine jejunum punches revealed that the presence of disulfides in the nanogels enabled the nanogels to overcome mucosal clearance mechanisms. The in vitro assay of the encapsulation of hydrophobic small molecular weight drug Budesonide (BUD) and hydrophilic protein Etanercept (ETN) demonstrates the nanogels’ potential for submucosal delivery of both anti-inflammatory actives. Finally, semi-interpenetration method was employed as a tool to adapt the thermo-responsive nanogels for systemic application in combination cancer therapy. The introduction of the near infrared (NIR)-transducing polymer polypyrrole (PPY) through physical entanglement of linear PPY chains into the nanogel network was found beneficial by complementing of properties of both without affecting each other. As a result, the semi-interpenetrated nanogels still exhibited the same VPTT as their thermo-responsive non-interpenetrated analogues but acted as excellent photothermal transducer with high photostability. This enabled the use of the generated heat by the PPY chains under NIR exposure for photothermal ablation of cancerous tissue as well as to trigger the thermo-responsive network and the release of an encapsulated drug. In addition, the photothermal transducing abilities could be used for the determination of ex vivo biodistribution profiles and time dependent tumor accumulation. The transducing property also translate the nanogels into contrast agents in photoacoustic (PA) imaging. Increased therapeutic outcomes against tumors could be demonstrated in vitro and in vivo induced by combination effects of the chemotherapeutic drug Methotrexate (MTX) delivered by the nanogels, and photothermal treatment with NIR light. Altogether, this thesis demonstrates that thermo-responsive nanogels are an excellent and variable platform for the delivery of a range of therapeutic actives. For the adjustment of the nanogels and the addition of useful functionalities, cross-linker modification and semi-interpenetration were proven to be efficient tools to broaden the range of applications from dermal to mucosal and systemic administration.

Responsive Nanogele haben sich als vielversprechende so genannte „smarte“ Wirkstoff-transportsysteme in nanometer Größe herausgestellt. Mit einer gezielten Freisetzung ihrer Cargos haben sie das Potential die pharmakokinetischen Profile der Medikamente zu verbessern und so Dosisgrenzen zu überwinden und das Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen zu reduzieren. Die Komplexität der auftretenden Krankheiten und die große Variabilität der möglichen therapeutischen Wirkstoffe, die vom kleinen Molekülen bis zu therapeutischen Protein reichen, machen es jedoch notwendig, die Carrier an die spezifischen Anforderungen anzupassen. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dieser Erfordernis mit dem Ziel durch die Identifizierung von Schlüsselparametern die Kontrolle über die Eigenschaften und die Struktur von responsiven Nanogelen zu erhalten. Des Weiteren sollen Anpassungskonzepte für die Nanogele entwickelt werden, um das Spektrum an Wirkstoffen sowie mögliche Anwendungsfelder zu erweitern. In einer umfassenden Untersuchung der Reaktionskinetik und der Nanogel-Bildung unter verschiedenen Bedingungen konnten die wichtigsten Faktoren zur Steuerung der Eigenschaften von thermo-responsiven Nanogelen identifiziert werden. Mit diesem Wissen konnte die Parameter Netzwerkdichte, Größe und Schwellfähigkeit der Nanogele für eine effiziente Verkapselung von Proteinen angepasst werden. Die Verwendung des thermo-responsiven Polymers Poly-N-Isopropylmethacrylamid (PNIPMAM) neben Poly-N-Isopropylacrylamid (PNIPAM) ermöglichte eine genaue Einstellung der Volumenphasenübergangstemperatur (VPTT) der resultierenden Nanogele im Bereich von 34 - 47 °C. Für alle Nanogele konnte eine temperaturbedingte Freisetzung der verkapselten Proteine in vitro und die Abgabe der Proteine in lebensfähige Hautschichten ex vivo nachgewiesen werden. Die Feinjustierung der Übergangstemperatur der Nanogele ermöglichte außerdem die Nutzung externer Wärmequellen, um die Freisetzung und Penetration von Proteinen in die Haut mit hoher Effizienz und unter zeitlicher und lokaler Kontrolle auszulösen. Als nächstes wurde die Anpassung der thermo-responsiven Nanogele für eine Verabreichung von entzündungshemmenden Medikamenten auf Mucus angestrebt. Daher wurde der Vernetzer der Nanogele mit Disulfiden modifiziert, die es den Nanogelen ermöglichen sollen, mit dem Mucus zu interagieren und so die mucus-korrelierten Clearance-Mechanismen zu überwinden. Durch die Spaltung von Disulfiden in Thiole unter reduktiven Bedingungen konnten Studien über die Abbauprofile der Nanogele als Nachweis für die erfolgreiche Integration der Disulfide in PNIPMAM-basierten Nanogele dienen. Im Gegensatz dazu wurde bei der Verwendung von PNIPAM, allein oder als Copolymer mit PNIPMAM, keiner oder nur ein teilweiser Abbau der resultierenden Nanogele beobachtet, was auf eine vorzeitige Spaltung der Disulfide während der Nanogelbildung hindeutet. Studien über die Wechselwirkung mit Mucus und die Penetration in frisch exzidierte Jejunum-Ausschnitte vom Schwein zeigten, dass das Vorhandensein von Disulfiden den Nanogelen ermöglichte, die Schleimschicht zu überwinden und unterliegende Zellschichten zu erreichen. Ein in vitro-Assay bezüglich der Eignung der Nanogele zur Verkapselung von hydrophobem, niedermolekularen Budesonid (BUD) und dem hydrophilen Protein Etanercept (ETN) zeigte das Potenzial der Nanogele für die submukosale Lieferung beider entzündungshemmenden Wirkstoffe. Schließlich wurde semi-Interpenetration als Methode zur Anpassung der thermo-responsiven Nanogele an die systemische Anwendung in der kombinatorischen Krebstherapie untersucht. Die Einführung des nahinfraroten (NIR) umwandelnden Polymers Polypyrrol (PPY) über eine physikalische Verflechtung linearer PPY-Ketten in das Netzwerk der thermo-responsiven Nanogele stellte sich als vorteilhaft heraus, da die Eigenschaften beider Systeme ergänzt wurden ohne sich gegenseitig zu beeinflussen. Die semi-interpenetrierten Nanogele zeigten immer noch die gleiche VPTT wie ihre thermo-responsiven, nicht-interpenetrierten Analoga, fungierten aber als exzellenter photothermischer Umwandler mit hoher Photostabilität. Dies ermöglichte die Nutzung der durch die PPY-Ketten unter NIR-Exposition erzeugten Wärme zur Auslösung des Volumenphasenübergangs des thermo-responsiven Netzwerks, zur Freisetzung eines verkapselten Medikaments, sowie zur photothermischen Ablation von Tumorgewebe. Darüber hinaus konnten die Fähigkeit zur Umwandlung von NIR in Wärme für die Bestimmung von ex vivo Biodistributionsprofilen und zeitabhängiger Tumorakkumulation genutzt werden. Die Eigenschaft der NIR-Umwandlung macht die Nanogele außerdem zu Kontrastmitteln in der photoakustische (PA) Bildgebung. Verbesserte therapeutische Ergebnisse gegen Krebstumore konnten durch Kombinationseffekte des von den Nanogelen freigesetzten Chemotherapeutikums Methotrexat (MTX) und der photothermischen Behandlung mit NIR-Licht in vitro und in vivo erzeugt werden. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass thermo-responisve Nanogele eine ausgezeichnete und variable Plattform für den Transport und die kontrollierte Freisetzung einer Reihe von therapeutischen Wirkstoffen sind. Für die Anpassung der Nanogele an wirkstoff- und krankheitsbedingte Anforderungen und die Ergänzung nützlicher Funktionen haben sich die Modifikation des Vernetzers und die semi-Interpenetration als effiziente Methoden erwiesen um das Anwendungsspektrum von dermal zu mukosal und systemisch zu erweitern.