Transcription networks in heart development and disease with detailed analysis of TBX20 and DPF3

Abstract

In this work an integrative approach was presented to analyze transcriptional networks directing cardiac gene expression and controlling heart muscle development and function. A special focus was the characterization of key genes in terms of their regulation factors and potential association with cardiac defects. Expression analysis of a high number of malformed human hearts enabled the identification of regulatory dependencies and disease- specific molecular portraits with interesting candidate genes and the detection of genes showing correlated expression patterns. To identify binding sites of common transcription factors potentially regulating the correlated genes, prediction settings were optimized using data derived from chromatin immunoprecipitation in cardiomyocytes. The transcription factors included in this analysis were also placed in the context of epigenetic marks by comparing the binding data to the distribution of a panel of histone modifications. The majority of binding sites carried several modified histone residues and histone 3 acetylation correlated with enhanced expression levels of Gata4 and Srf targets. Knockdown of the respective transcription factors by siRNAs revealed that they mainly act as activators. Finally, cardiac transcriptional networks were constructed using bioinformatic analysis of the expression profiling, chromatin immunoprecipitation and siRNA-experiments. The transcription factors TBX20 and DPF3 were upregulated in patients with the complex cardiac disease Tetralogy of Fallot and raised particular interest as they had not been associated with congenital heart defects in human before. We analyzed the human TBX20 gene regarding its splice variants, promoter and provided for the first time direct upstream regulators that play a role in cardiac development. Tfap2 proteins were found to repress, Gata4, Mef2a, Nkx2.5 and Srf to activate Tbx20 expression. Characterization of DPF3 revealed it as a novel epigenetic transcription factor that is essential for cardiac and skeletal muscle development and function. Using tandem affinity purification technique we identified the BAF chromatin remodeling complex as interaction partner. DPF3 contains the first PHD finger known to bind acetylated and methylated histones. It potentially links the BAF complex in a histone modification specific manner to DNA, by serving as tissue-specific subunit that regulates the transition of muscle precursors to differentiating myocytes. In conclusion, this work integrated clinical, phenotypic and molecular data, providing insight into cardiac regulatory networks in general and into the functions of key transcription factors in particular.

In dieser Arbeit wurde ein integrativer Ansatz für die Analyse von transkriptionellen Netzwerken dargestellt, welche Mechanismen der Entwicklung und Funktion von Herzmuskelzellen kontrollieren. Ein besonderer Schwerpunkt lag auf der Untersuchung interessanter Schlüsselgene bezüglich ihrer Regulation und möglichen Verbindung zu angeborenen Herzfehlern. Die Expressionsanalyse einer großen Anzahl von Patienten mit angeborenen Herzfehlern ermöglichte die Identifizierung regulatorischer Zusammenhänge und krankheitsspezifischer molekuarer Profile. Außerdem konnten interessante Kandidatengene entdeckt werden sowie Transkripte, die ein stark korreliertes Expressionsmuster in allen Herzproben aufwiesen. Bei der Vorhersage von Bindestellen gemeinsamener Transkriptionsfaktoren, die möglicherweise die korrelierten Gene regulieren, wurden die Einstellungen und Variablen der Methode durch Integration von Chromatin Immunpräzipitations (ChIP) Daten aus Herzmuskelzellen optimiert. Die in dieser Analyse enthaltenen Transkriptionsfaktoren wurden außerdem im Zusammenhang mit epigenetischer Regulation untersucht. Dazu wurden die Informationen der Bindestellen mit Daten über eine Reihe von Histonmodifikationen verglichen. Die meisten der Bindestellen wiesen mindestens eine epigenetische Markierung auf und die Histon 3 Acetylierung korrelierte mit einer gesteigerten Expression von Gata4 und Srf Zielgenen. Die Herunterregulation der einzelnen Transkriptionsfaktoren offenbarte, dass diese hauptsächlich aktivierende Funktion ausübten. Anhand statistischer Analysen und bioinformatischer Modellierungen konnten schließlich basierend auf den Daten der Expressionsprofile, ChIP- und siRNA- Experimente transkriptionelle Netzwerke erstellt werden. Einige der gefundenen Bindungen von Transkriptionsfaktoren an Zielgene wurden durch in der Literatur beschriebene Regulationsmechanismen bestätigt. Besonderes Interesse riefen dabei die Transkriptionsfaktoren TBX20 und DPF3 hervor, da sie in Patienten mit der komplexen Herzkrankheit Fallot Tetralogie stark hochreguliert waren und bisher nicht mit angeborenen Herzfehlern assoziiert wurden. Das TBX20 Gen wurde hinsichtlich seiner Splicevarianten und Promoterregion beim Menschen charakterisiert. Es wurden zum ersten Mal direkte Regulatoren gefunden, die essentiell für die Herzentwicklung sind, wobei TFAP2 als Repressor, Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf als Aktivatoren von TBX20 entdeckt wurden. Funktionsanalysen von DPF3 ergaben, dass das Protein die ersten bekannten PHD Finger enthält, die sowohl methylierte als auch acetylierte Histone binden können. Dieser neue epigenetische Transkriptionsfaktor spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Funktion von Herz- und Skelettmuskelzellen. Durch Affinitätsaufreinigung wurde des weiteren der BAF Chromatin Remodeling Komplex als Interaktionspartner entdeckt. Möglicherweise verknüpft DPF3 diesen Proteinkomplex abhängig von spezifischen Histonmodifikationen an die DNA und dient eventuell als gewebespezifische Untereinheit bei der Regulation von Muskelvorläufern zu sich differenzierenden Muskelzellen. Zusammenfassend integriert diese Arbeit klinische, phänotypische und molekulare Daten, wodurch Einblicke in regulatorische Netzwerke von Herzzellen allgemein sowie in Funktionen von wichtigen herzspezifischen Transkriptionsfaktoren ermöglicht wurden.