Charakterisierung kovalent reversibler Inhibitoren der Enterovirus D68 3C Protease und ihre Bildung durch Protein-induzierte Knoevenagel-Reaktion

Abstract

Enterovirale Infektionen stellen ein weltweites gesundheitliches Problem dar, das bisher nicht effizient durch wirksame Impfstoffe eingedämmt werden konnte. Die enterovirale 3C Protease als hochkonservierte Struktur ist elementar für die Virusvermehrung und ein attraktives Ziel für Arzneistoffe. Die bisherige Forschung an peptidischen Leitstrukturen lieferte Rupintrivir als hochpotenten 3C Proteaseinhibitor, der jedoch wegen fehlender Wirksamkeit gegen HRV bei Patienten mit natürlich erworbenen Erkältungskrankheiten in der klinischen Phase III scheiterte. Aufgrund ungünstiger pharmakokinetischer Eigenschaften der Peptide konzentrierte man sich auf die Entwicklung niedermolekularer Inhibitoren, doch viele dieser Verbindungen waren entweder nicht ausreichend wirksam oder zu unselektiv und toxisch. In dieser Arbeit wurden kovalent reversible Inhibitoren der viralen 3C Protease von EV D68 hinsichtlich ihrer Wirkung, den thermodynamischen und kinetischen Eigenschaften der Protein-Inhibitor-Bindung und ihrer Bildung systematisch untersucht. Die synthetisierten Knoevenagel-Produkte waren sowohl im FRET-Assay mit isolierter Protease als auch im Zellassay im niedrigen und mittleren mikromolaren Bereich wirksam und nicht-toxisch. Reaktionen mit konkurrierenden Nukleophilen wie Glutathion und DTT und die Retro-Knoevenagel-Reaktion erklärten Diskrepanzen zwischen den Aktivitäten beider Assays. Sowohl die Reaktivität als auch die Stabilität der Knoevenagel-Produkte und der Protein-Inhibitor-Komplexe hingen mit dem Ausmaß des Elektronenzugs durch die Substituenten der vormals CH-aziden Verbindung zusammen. Für einen potenten und selektiven kovalent reversiblen Inhibitor war ein starker elektronenziehender Rest, der eine Resonanzstabilisierung ermöglicht, in α-Position des Michael-Systems erforderlich. Eine chemische Verschiebung von etwa 7.8 ppm für das β-Proton im 1H-NMR gewährleistete dabei sowohl eine ausreichende Aktivierung für den Angriff des Cysteins im aktiven Zentrum als auch die Unterdrückung der Retro-Knoevenagelreaktion. Die Stabilität der Protein-Inhibitor-Komplexe wurde mittels ITC und Massenspektrometrie beurteilt. Es wurde herausgefunden, dass α-substituierte Michael-Akzeptoren die gesamte Bandbreite von sehr langsam reversiblen Addukten bis hin zu Protein-Inhibitor-Komplexen mit sehr schneller Kinetik abbilden. Eine sehr langsame Kinetik korrelierte dabei mit einer guten zellulären Wirkung und unterstrich die Wichtigkeit der verlängerten Residenzzeit am Zielprotein für eine optimale Inhibition. Verwirklicht wurden diese Aspekte im Malonsäurediethylester-Derivat 33, das einen potenten, selektiven und nicht toxischen Inhibitor der EV D68 3CPro darstellt. Die Hypothese, dass das Oxoanionloch der 3CPro, das mit positiver Partialladung ausgekleidet ist, als Katalysator fungiert und die Reaktivität von Carbonylgruppen erhöht, konnte in dieser Arbeit bestätigt werden. Es wurde gezeigt, dass die Reaktion zwischen 3-Formylbenzamid 1 und 3-Oxobutannitril Protein-katalysiert abläuft und ein verbesserter Inhibitor gebildet wurde. Die Knoevenagel-Kondensation als C-C-Bindungs-knüpfende Reaktion erweitert damit das Repertoire der für die Fragmentligation nutzbaren bioorthogonalen, chemischen Reaktionen.

Infections by enteroviruses are a worldwide health threat that could not be confined by effective vaccines yet. The enteroviral 3C protease is a highly conserved structure and displays an attractive drug target. Previous research on peptidic leads yielded Rupintrivir as a highly potent 3C protease inhibitor that failed in clinical phase III because of lack of efficacy in patients suffering from naturally acquired colds. Because of unfavourable pharmacokinetic properties of peptide drugs, now the focus is on the development of small molecule inhibitors, but many of them were not effective or too unselective and toxic. In this work the effect, the thermodynamical and kinetic properties of the protein-inhibitor-binding and the formation of covalent reversible inhibitors of the viral 3C protease were investigated systematically. The synthesized Knoevenagel-products were active and non-toxic in a low and medium micromolar range in the FRET-assay using isolated protease as well as in the cell assay. Discrepancies in both assays were explained by reactions with competing nucleophiles like glutathione and DTT and the Retro-Knoevenagel-reaction. Both the reactivity and the stability of the Knoevenagel-products and the protein-inhibitor-complexes were related to the extent of the electron withdrawing effect by the substituents of the former CH-acidic compound. A potent and selective covalent reversible inhibitor required a strong electron withdrawing moiety allowing resonance stabilization in α-position of the Michael-system. A chemical shift of ca. 7.8 ppm for the β-Proton in the 1H-NMR provided both a sufficient activation for the attack of the active site cysteine and suppression of the Retro-Knoevenagel-reaction. The stability of the protein-inhibitor-complexes was evaluated by ITC and mass spectrometry experiments. It was shown, that α-substituted Michael-acceptors cover the whole spectrum from slow reversible adducts towards protein-inhibitor-complexes with very fast kinetics. Very slow kinetics correlated with a good cellular activity and emphasized the importance of a prolonged residence time at the target protein for optimal inhibition. These aspects were implemented in the diethyl malonate 33, which displays a potent, selective and non-toxic inhibitor of EV D68 3CPro. The hypothesis, that the oxoanion hole of the 3CPro, which is partially positively charged, is able to serve as a catalyst, increasing the reactivity of carbonyl groups, was verified in this work. It was shown, that the reaction between 3-formylbenzamide 1 and 3-oxobutanenitrile was protein-catalyzed and yielded an enhanced inhibitor. Thereby the Knoevenagel-condensation as a C-C-bond-forming reaction expands the repertoire of the bioothogonal chemical fragment ligation reactions.