Immunological and translational consequences of an altered CD8+ T cell cytolytic activity

Abstract

Grundlage der adoptiven Immuntherapie ist die antigen-spezifische Stimulation, Aktivierung und Expansion autologer T-Zellen ex vivo und deren Reinfusion in den Patienten. Die gezielte genetische Veränderung der zu transferierenden T-Zellen ermöglicht es zum Beispiel ihre Avidität zu erhöhen, indem hochaffine T-Zell-Rezeptoren oder chimäre Antigenrezeptoren (CAR) eingebracht werden. Um jedoch die Etablierung eines immunologischen Gedächtnisses zu gewährleisten, ist es ebenso wichtig, dass diese T-Zellen zu langlebigen Gedächtniszellen differenzieren können. EBAG9 ist ein negativer Regulator der Sekretion von Effektormolekülen und kann die sekundäre Immunantwort beeinflussen. Es wird daher vermutet, dass die Modulierung des EBAG9-regulierten sekretorischen Signalweges eine alternative Strategie ist, um die Wirksamkeit von adoptiv transferierten T-Zellen zu erhöhen. In der vorliegenden Arbeit konnte zunächst gezeigt werden, dass die verstärkte zytolytische Aktivität von T-Zellen in EBAG9-defizienten Mäusen mit einer präferentiellen Differenzierung zu Gedächtniszellen verbunden ist. Es wurden keine Unterschiede in der Frequenz von Effektor-T-Zellen oder in der Expression von spezifischen Oberflächenrezeptoren beobachtet. Im Gegensatz dazu konnte nachgewiesen werden, dass die mit einer Gedächtniszelldifferenzierung assoziierten Transkriptionsfaktoren EOMES, T-bet, ID3 und der IL-12Rβ Signalweg differentiell rekrutiert wurden. Dementsprechend scheint die Antigenverfügbarkeit abhängig von der EBAG9-vermittelten zytolytischen Aktivität zu sein und die Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses zu beeinflussen. Im Weiteren wurden EBAG9-spezifische micro RNAs (miRNAs) generiert, die zu einer sequenzspezifischen Herunterregulation von EBAG9 führten. Die Unterdrückung der EBAG9-Expression erhöhte spezifisch die Sekretion von Granzym A und die zytolytische Aktivität von primären murinen und humanen T-Zellen. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass auch die in vitro und in vivo Antitumoraktivität von CAR T Zellen verbessert wurde. Da eine gesteigerte T-Zell-Funktion in Folge der Herunterregulation von EBAG9 sowohl für BCMA als auch für CD19 CAR T-Zellen beobachtet werden konnte, scheint es sich hierbei um einen universell anwendbaren zellbiologischen Mechanismus zu handeln. Unspezifische Effekte bezüglich Persistenz, Erschöpfung oder Differenzierung der modifizierten T Zellen wurde mithilfe einer repetitiven in vitro Antigenstimulation ausgeschlossen. Die Modulation des sekretorischen Signalweges in T Zellen mittels einer miRNA-vermittelten Herunterregulation der EBAG9-Expression scheint dementsprechend eine geeignete Strategie zu sein, um die Effizienz der adoptiven T Zell-Therapie zu erhöhen.

Adoptive immunotherapy relies on the antigen-specific stimulation, activation, and expansion of autologous T cells ex vivo and reinfusion into the patient. Moreover, genetic engineering of cytotoxic T cells (CTLs) prior to reinfusion involves enhancing CTL function by the expression of high-affinity T cell receptors or chimeric antigen receptors (CARs). In addition to endowing CTLs with high avidity, the transfer of long-lived CTLs is important as it ensures for long-term immunological memory and, therefore, protection against tumor relapse. Because EBAG9 is a negative regulator of effector molecule secretion and suggested to interfere with CTL memory formation, targeting the secretory pathway of T cells via EBAG9 may be an alternative strategy to enhance the efficacy of adoptively transferred T cells. This thesis explored whether the cytolytic strength of CD8+ T cells influences memory differentiation. By employing the strong Tag neoantigen and the minor histocompatibility mismatch antigen HY, increased cytolytic strength at the same effector cell frequencies could be linked to an expanded memory population in EBAG9-deficient mice. Although lineage-determining surface markers were expressed equally, differential recruitment of the transcription factors EOMES, T-bet, ID3 and the IL-12Rβ pathway was consistent with preferential memory formation. Collectively, antigen availability over time appears to be controlled by EBAG9-mediated cytolytic activity and contributes to the formation of a CD8+ T cell memory pool. To further investigate whether targeting EBAG9 increases the efficacy of adoptively transferred T cells, efficient sequence-specific miRNAs were generated. The miRNA-mediated silencing of EBAG9 specifically increased granzyme A secretion, while the release of effector cytokines remained unaffected. Furthermore, the engineered downregulation of EBAG9 enhanced the cytolytic capacity of mouse and human CTLs. Most importantly, the in vitro and in vivo antitumor activity of CAR T cells could be further enhanced by EBAG9 knockdown and therefore, effective dose levels were decreased. The cytolytic activity of BCMA and CD19 CAR T cells was increased by the silencing of EBAG9, indicating that this mechanism is a universally applicable principle of cell biology in murine and human CTLs. Adverse effects of the miRNA-mediated silencing of EBAG9 in regard to T cell persistence, exhaustion, or differentiation were excluded by an in vitro repetitive antigen stimulation assay. Targeting the secretory pathway of T cells by the engineered downregulation of EBAG9 is, therefore, a suitable strategy to increase the efficiency of adoptive T cell therapy.