Genome sequencing and molecular typing of Clostridium chauvoei

Abstract

High quality circular genome sequences were generated for the Clostridium chauvoei type strain DSM 7528T (ATCC 10092T) and a field strain 12S0467 isolated in Germany. Comparative genome analysis of the two strains revealed few inversions and translocations in local collinear blocks, indicating a conserved genome with only a small number of accessory genes. Significant homology for C. chauvoei was observed with C. septicum. The species genome shows a large number of genes, the products of which are involved in proteolysis, cleavage of glycosidic linkages (sialidases) and metal ion transportation. Triplicates of fliC were identified in each of the two circular genomes. Sporulation and germination process related genes were homologous to those of the Clostridia cluster I species with highest homology to C. septicum, but novel variations in regulatory genes were also identified. A comparative genomic study was carried out with a total of 64 C. chauvoei strains. The strain collection mostly included strains of European origin whereas few strains were of exotic origin. Pan-genome analysis of the species based on the available C. chauvoei strains shows that the species has an open pan-genome structure. New gene acquisition was observed to be very limited. This probably indicates that the species is undergoing replication only in very isolated areas e.g. inside the host tissue, so that the chances of acquiring foreign genetic material are limited. The predicted prophage identified in the genomes was similar for all strains, indicating that the genomes are immune to any new phage type. A CRISPR type I-B system was identified in all genomes which may contribute to comprehensive phage immunity. There was an obvious correlation of strains from the same region/farm i.e. displaying the same repeat numbers/spacer sequences. The strains originating from outside Europe showed a unique spacer matrix composition. Homologous recombination plays an important role in the evolution of some bacterial pathogens. This study found only a limited number of possible recombination events contributing towards the evolution of C. chauvoei. Maximum Likelihood phylogenetic analysis based on the core genome (Parsnp) identified associated isolates with strong bootstrap support values (100%). These values were highly prominent for strains originating from the same farm/outbreak/animal. Reference genome and alignment free analysis methods (kSNP 3) based on pan-genome SNPs (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) were found to be useful for initial clustering of isolates. The strains were clustered based on unique SNPs. The number of allele specific SNPs which are unique for each strain was higher for strains from exotic origin. Read mapping and SNP calling (Snippy) based on a related reference genome (12S0467) was able to provide novel insights to understand the general, outbreak and within-host microevolution of a pathogen. The median pairwise SNP difference value was higher for C. chauvoei strains from Bavaria and Austria as compared to strains from Lower Saxony. The diversity of geographically related strains could therefore be indicative of other environmental factors or herd management influencing strain microevolution. Nonsynonymous SNPs contributed significantly to the observed microevolution of the pathogen. Based on the strain variability observed for strains from the same host and strains from the same outbreak, this study also proved the possibility of genetically different C. chauvoei populations in one host. A very recent study, based on genome sequence data, has pointed out the applicability of strain differentiation based on CRISPR spacer sequences for C. chauvoei. The current study similarly proved the applicability of typing approaches for this pathogen based on CRISPR elements and core genome MLST. The CRISPR spacer diversity was found to be inadequate to differentiate strains of European origin. However core genome MLST was able to differentiate the C. chauvoei strains within Europe and Germany and thus proved to be a valuable tool for strain differentiation. The current study applied the advantage of long read based sequencing technology to generate high quality complete genome reference sequences for a field strain from Germany and the type strain of C. chauvoei. The phylogenetic positioning of the species within the genus was evaluated and the close relatedness to C. septicum was confirmed. Several genome analysis software tools provided novel insights in the genome content and composition of the pathogen. Comparative genome sequence analysis based on 64 strains showed limited horizontal gene transfer and novel gene acquisition. Strain typing based on core genome MLST analysed used the first time for this species could differentiate strains even at farm level.

Zwei vollständige, zirkuläre Genomsequenzen von hoher Qualität wurden für den Clostridium chauvoei Typstamm DSM 7528T (ATCC 10092T) und dem in Deutschland isolierten Feldstamm 12S0467 generiert. Die vergleichende Genomanalyse der beiden Stämme zeigte wenige Inversionen und Translokationen in lokal kollinearen Blöcken. Dies weist auf ein konserviertes Genom mit nur einer kleinen Anzahl von Zusatzgenen hin. Für C. chauvoei wurde eine signifikante Homologie mit C. septicum beobachtet. Das Speziesgenom beinhaltet zudem eine große Anzahl von Genen, deren Produkte an Proteolyse, der Spaltung von glycosidischen Bindungen (Sialidasen) und Metallionen-Transport beteiligt sind. In jedem der beiden vollständigen Genome wurden drei Kopien des Gens fliC identifiziert. Sporulations- und Keimungsprozeß-bezogene Gene waren homolog zu denen anderer Arten des Clostridien Clusters I, mit der höchsten Homologie zu C. septicum. Aber es wurden auch neue Variationen in diesen regulatorischen Genen identifiziert. Eine vergleichende genomische Studie wurde mit insgesamt 64 C. chauvoei-Stämmen durchgeführt. Die Stammsammlung enthielt zum größten Teil Stämme europäischer Herkunft, während wenige Stämme exotischen Ursprungs waren. Die Pan-Genom-Analyse der verfügbaren C. chauvoei Stämme zeigt, dass die Spezies eine offene Pan-Genom-Struktur aufweist. Die Akquisition neuer Gene wurde selten beobachtet. Dies deutet wahrscheinlich darauf hin, dass die Spezies nur in sehr isolierten Bereichen repliziert, z. B. innerhalb des Wirtsgewebes, sodass die Chancen, fremdes genetisches Material zu erwerben, begrenzt sind. Der in den Genomen identifizierte Prophage war bei allen Stämme gleichartig, was darauf hinweist, dass die Genome dieser Spezies für jeden neuen Phagentyp immun sind. Ein CRISPR- Typ-I-B-System wurde in allen Genomen identifiziert, dieses trägt wahrscheinlich zur umfassenden Phagen-Immunität bei. Es gibt eine offensichtliche Übereinstimmung der Repeat-Zahlen/Spacer-Sequenzen der Stämme aus der gleichen Region/aus dem gleichen Betrieb. Stämme mit geographischem Ursprung außerhalb Europas hatten eine einzigartige Spacer-Matrix Zusammensetzung. Homologe Rekombination spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einiger bakterieller Pathogene. Diese Studie weist lediglich auf eine eingeschränkte Anzahl von möglichen Rekombinationsereignissen hin, die zur Evolution von C. chauvoei beigetragen haben. Die „Maximum-Likelihood“ phylogenetische Sequenzanalyse basierend auf dem Core-Genom (Parsnp) identifizierte zusammengehörige Isolate mit hohen Bootstrap-Test-Werten (100%). Diese waren besonders markant bei Isolaten, die aus demselben Ausbruch/Betrieb/Tier stammten. Referenzgenom- und Alignment-freie (kSNP3) Analysemethoden auf der Basis von Pan-Genom-SNPs (SNP, engl. Single Nucleotide Polymorphism, Einzelnukleotid-Polymorphismus) waren für das initiale Clustering von Isolaten geeignet. Das Clustering der Stämme erfolgte anhand spezifischer SNPs. Die Anzahl allel-spezifischer SNPs, die für jeden Stamm einzigartig sind, war bei Stämmen exotischen Ursprungs höher. Read-mapping und SNP-calling (Snippy), auf der Basis eines verwandten Referenzgenoms (12S0467) können neue Einblicke zum Verständnis der generellen, ausbruchsbezogenen und im Wirt ablaufenden Mikroevolution eines Erregers ermöglichen. Der mediane paarweise SNP-Differenzwert war für Stämme aus Bayern und Österreich im Vergleich zu Stämmen aus Niedersachsen höher. Die Diversität geographisch verwandter Stämme könnte darauf hinweisen, dass Umweltfaktoren oder das Herden-Management die Mikro-Evolution der Stämme beeinflussen. Nicht-synonyme SNPs trugen wesentlich zu der beobachteten Mikro-Evolution des Erregers bei. Die beobachtete Variabilität von Stämmen aus dem gleichen Tier und Stämmen aus dem gleichen Ausbruch zeigt, dass genetisch verschiedene C. chauvoei Populationen in einem Wirt vorhanden sein können. Eine kürzlich publizierte, auf Genomsequenzdaten basierende Studie hat gezeigt, dass CRISPR-Spacer- Sequenzen von C. chauvoei für die Stamm-Differenzierung genutzt werden können. Die aktuelle Studie beweist die Eignung von CRISPR-Typing und Core-Genom MLST. Bei den hier untersuchten Stämmen war die Diversität der CRISPR-Spacer- Sequenzen nicht ausreichend, um Stämme europäischen Ursprungs weiter zu differenzieren. Mittels Core-Genom MLST war die Differenzierung von Stämmen mit europäischem und deutschem Ursprung möglich. Sie ist deshalb ein wertvolles Werkzeug zur Unterscheidung von Stämmen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Vorteil von Sequenzier-Techniken mit langen Leseweiten genutzt, um zwei qualitativ hochwertige, komplette Referenz-Genomsequenzen für ein Feldisolat aus Deutschland und den Typstamm von C. chauvoei zu erzeugen. Die phylogenetische Position der Spezies innerhalb des Genus wurde evaluiert und eine nahe Verwandtschaft zu C. septicum bestätigt. Verschiedene Genom-Analyse- Programme ermöglichten neue Einblicke in die Genomzusammensetzung und in den Genominhalt des Erregers. Eine vergleichende Genomsequenz-Analyse anhand von 64 Stämmen zeigte für den Erreger einen eingeschränkten horizontalen Gentransfer und eingeschränkten Erwerb neuer Gene. Die Typisierung von Stämmen auf der Basis der Core-Genom MLST, die zum ersten Mal für die Spezies untersucht wurde, ermöglichte sogar die Differenzierung von Stämmen auf Betriebsebene.