dc.contributor.author
Mohammed, Sara Basher Taha
dc.date.accessioned
2018-06-07T16:33:40Z
dc.date.available
2015-10-08T11:34:33.654Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2711
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6912
dc.description.abstract
Theileria annulata is an obligate intracellular parasite that causes great
health problems in cattle and domestic buffalo in tropical and subtropical
areas. The parasite is transmitted transstadially by several species of
Hyalomma ticks. T. annulata has a unique ability to transform and to induce a
permanent proliferation of bovine leukocytes in a similar manner as tumor
cells do. Among others, this transformation results in clonal expansion and
metastasis of the infected cells in various organs of the affected animal. The
mechanism (s) underlying the transformation process is still not entirely
clear. However, in the last years, it has been found that a number of genes
are involved in the regulation of cell proliferation and / or apoptosis such
as NF-κB, PI-3k/Akt and Heat shock proteins (HSPs). Moreover, HSP90 has been
shown to be involved in the host cell proliferation/apoptosis as well as in
stage differentiation of parasites. Accordingly, this work was designed: i) To
investigate the functional role of HSP90 in the maintenance of the cell
viability and proliferation ii) To analyse the differential expression profile
of HSP90 in T. annulata Ankara 288-infected cells under stress conditions iii)
To investigate the role of HSP90 during the developmental stages of the
parasite. In a number of studies, geldanamycin (GA) was used to inhibit the
HSP90 function in cell proliferation and survival. In the present work, I also
used this drug to dissect a possible impact of the HSP90 on the host-parasite
interaction in Theileria-transformed bovine cells. As a first step, the effect
of HSP90 inhibition by GA on the cell viability was examined at 37°C by Trypan
blue test. The percentages of dead cells were determined and was less than 20%
in the cells incubated with GA (0.5 μM or 1μM) for 1 day, while this
percentage increased up to 66% after 2 days. The treatment with GA ≥ 5μM
showed more than 60% of dead cells after 1 day and increased up to 100% after
2 days. The flow cytometric assays for apoptosis was carried out on one hand,
to verify the previous result and on the other hand, to investigate the effect
of GA (0.001μM-0.5μM) at 37°C and 41°C. The analysis revealed that GA induced
significant apoptosis in T. annulata Ankara 288- infected cells in a dose- and
time- dependent manner. The effect of GA depended also on the incubation
temperature, where low concentrations of GA could significantly induce
apoptosis at 41°C. These findings were confirmed by the immunofluorescence
staining of host cell p53 as a great accumulation of p53 was observed in the
host cell nucleus after treatment with GA. The cell proliferation analysis by
flow cytometry showed a significant reduction in the cell proliferation after
treatment with GA ≥ 0. 05 μM for 3 days, while after 6 days incubation at 37°C
only GA ≥ 0.25 μM has a similar effect. The effect of HSP90 inhibition on the
parasite differentiation in T. annulata Ankara 288- infected cells was
evaluated by using two different methods. The first method was
immunofluorescence staining using specific antibodies against TamS1 and TamR1,
which can detect those cells in which schizonts differentiate to merozoites.
The qRT-PCR was applied as another method to evaluate the expression level of
TamR1 gene during the parasite differentiation. Both methods revealed that the
number of the cells undergoing merogony increased in T. annulata Ankara
288-infected cells after GA treatment regardless of the incubation
temperature. The regulation of bovine HSP90 genes (BHSP90-alpha and
BHSP90-beta) and T. annulata HSP90 genes (TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4) in T.
annulata Ankara 288-infected cells was evaluated by qRT-PCR. The qRT-PCR
analysis showed that the mRNA expression levels of BHSP90-alpha and
BHSP90-beta were significantly up-regulated after treatment with GA in a dose-
and time dependent manner. In agreement with a previous result, the expression
levels of TaHSP90-Chr1 mRNA and TaHSP90-Chr4 mRNA were slightly up-regulated
after GA treatment at 37°C. An interesting finding was the significant
decrease in the expression level of TaHSM90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 in the cells
incubated with GA at 41°C. This variance raised an important requirement for
tools to distinguish between T. annulata HSP90 and bovine HSP90. As mentioned
above, reference sequences of two isoforms of T. annulata HSP90 were found and
named TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4. Characterization of TaHSP90-Chr1 and
TaHSP90-Chr4 gene and its protein forms was carried out using molecular
biological methods and bioinformatic analysis. Phylogenetic tree analysis
indicated that TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 are more closely related to HSP90
from Theileria species and B .bovis than to HSP90 from human or bovine. Both
TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 showed most of the characteristics reported for
HSP90 e.g. the presence of ATP sequence, the presence of the functional HSP
domain and the existence of a signal sequence located in the N-terminal
sequence of the TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4. Antigenic peptides were deduced
from the sequence of TaHSP90-Chr1 and TaHSP90-Chr4 using the predication
server Predicting Antigenic Peptides (http://imed.med.ucm.es
/Tools/antigenic.pl). The selected peptide was synthesized and used to
immunize two rabbits. However, the anti- T. annulata HSP90 antiserum failed to
recognize T. annulata HSP90 (native protein). Regarding bovine HSP90,
immunoblotting staining carried out using anti-human HSP 90α/β (HSP 90α/β
(F-8): sc-13119, Santa Cruz) showed the ability of anti-human HSP 90α/β to
detect bovine HSP90 in the cell lysates. Moreover, the immunofluorescence
staining of T.annulata Ankara 288-infected cells showed the specificity of
this antibody. Novobiocin was used as an alternative method to distinguish
between the role of bovine HSP90 and T. annulata HSP90. Although, novobiocin
was utilized as a specific inhibitor of bovine HSP90, the novobiocin treatment
resulted in death of the parasites also. Whether this was a direct effect on
the parasite or rather on the host cell is not clear. Nevertheless, the
results of this study showed that the inactivation of HSP90 in T. annulata
Ankara 288-infected cells leads to cell cycle arrest, apoptosis and
differentiation of the schizonts to merozoites.
de
dc.description.abstract
Theileria annulata gehört zu den lymphoproliferativen Theilerien des Rindes.
Der Parasit wird duch Hyalomma-Zecken transstadial übertragen und verursacht
bei Tieren die Tropische Theileriose in subtropischen und tropischen Regionen.
Eine wichtige Eigenschaft dieser Erkrankung ist die unkontrollierte
Proliferation/ Transformation der befallenen Leukozyten infizierter Wirte, die
einige Eigenschaften der Tumorzellen erlangen, wie z. B. „Clonal Expansion“
und „Metastasis“ der infizierten Zellen in verschiedenen Organen des betroffen
Wirtes. Die der Transformation der Wirtszellen zugrunde liegenden molekularen
Mechanismen sind noch weitgehend ungeklärt. In den letzten Jahren wurden
einige Wirts- und Parasitenmoleküle identifiziert, die möglicherweise an der
Wirtszellproliferation bzw. -apoptose beteiligt sind, wie zB. NFkB und P53. Es
wird zunehmend auf die Rolle der Hitzeschockproteine (HSP) bei der Regulation
der Zellapoptose hingewiesen. Darüber hinaus wird über die Bedeutung von HSP90
bei der Differenzierung bestimmter Parasitenstadien berichtet. Die Hauptziele
der vorliegenden Doktorarbeit waren: i) Die Rolle von HSP90 bei der
Aufrechterhaltung der Vitalität und Proliferation T. annulata-infizierter
Zellen zu untersuchen, ii) das Expressionsprofil von HSP90 unter
Stressbedingungen in T. annulata-infizierten Zellen zu analysieren und iii)
die Bedeutung von HSP90 bei der Differenzierung der Schizonten zu Merozoiten
zu klären. In eine Reihe von Untersuchungen wurde Geldanamycin (GA) benutzt,
um die Funktion von HSP90 zu inhibieren und dessen Einfluss auf Proliferation
und Vitalität der Zellen zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurde GA
auch verwendet, um einen möglichen Einfluss von HSP90 auf die Wirt-Parasiten-
Interaktion in Theileria-transformierten bovinen Zellen zu untersuchen. Zu
nächst wurden die parasitenhaltigen Zellen mit verschiedenen Konzentrationen
von Geldanamycin (GA) behandelt und anschließend für unterschiedliche Zeiten
bei 37°C inkubiert. Der Effekt wurde mit dem Trypan-Blau-Test untersucht. Bei
einer GA Konzentration von 0.5 μM und 1μM und einer Inkubationszeit von einem
Tag bei 37°C, lag der prozentuale Anteil toter Zellen bei weniger als 20%.
Diese Zahl stieg jedoch breits nach zwei Tagen auf 66%. Mehr als 60% der für
einen Tag mit ≥ 5μM GA behandelten Zellen waren tot. Bei einer Verlängerung
der Inkubationszeit auf 2 Tage waren alle Zellen abgestorben. Zur Klärung der
Frage, ob die Apoptose ursächlich für den Tot der Zellen verantwortlich ist,
wurde eine Durchfluss-Zytometrie zur Erfassung apoptotischer Zellen
durchgeführt. Darüber hinaus wurde das gleiche Verfahren zur Untersuchung des
Effektes von geringeren Konzentrationen von GA (0.001 μM-0.5 μM) bei 37°C und
41°C eingesetzt. Die Analyse der erzielten Ergebnisse zeigte, dass GA die
Apoptose in T. annulata Ankara288-infizierten Zellen in Abhängigkeit von Dosis
und Inkubationszeit signifikant induzieren kann. Der Effekt von GA hing dabei
auch von der Inkubationstemperatur ab, wobei auch niedrige Konzentrationen von
GA bei 41°C eine Apoptose signifikant induzieren konnten. Diese Ergebnisse
wurden durch eine Immunofluoreszenz-Färbung des Wirtszellproteins p53
bestätigt. Hierbei wurde eine hohe Akkumulation von p53 im Wirtszellkern nach
der Behandlung mit GA nachgewiesen. Die Analyse der Zellproliferation mit
Hilfe der Durchfluss-Zytometrie zeigte eine signifikante Reduzierung der
Zellproliferation nach der Behandlung mit GA ≥ 0.05μM für 3 Tage. Ein
ähnlicher Effekt wurde mit einer Inkubationszeit von 6 Tagen und einer
Konzentration von GA ≥ 0.25μM erzielt. Der Effekt von HSP90 auf die
Differenzierung der Parasitenstadien wurde mit Hilfe zweier Methoden
untersucht. So wurde zum einen eine Immunofluoreszenz-Färbung mit den
spezifischen Merozoiten-Markern TamS1 und TamR1 durchgeführt. Zum anderen
wurde eine qRT-PCR zur Bestimmung der Höhe der Genexpression von TamR1
durchgeführt. Beide Methoden zeigten, dass die Anzahl der Zellen in Merogonie
nach der Behandlung mit GA steigt, unabhängig von der Inkubationstemperatur.
Die Regulation des bovinen HSP90-Gens (BHSP90-alpha und BHSP90-beta) sowie des
T. annulata HSP90-Gens (TaHSP90-Chr1 und TaHSP90-Chr4) wurde mit Hilfe einer
qRT-PCR evaluiert. Beide Isoformen des bovinen Gens zeigten eine signifikante
Hochregulation nach der Behandlung mit GA in einer konzentrations- und
inkubationszeitabhängigen Weise. Die Expression der TaHSP90-Chr1 mRNA und
TaHSP90-Chr4 mRNA war auch von der Inkubationstemperatur abhängig. Während die
Expression der mRNA beider Parasiten-HSP90-Isoformen nach der Behandlung der
Zellen mit GA bei 37°C leicht, jedoch nicht signifikant hochreguliert war,
nahm die Expression der mRNA dieser Gene bei 41°C signifikant ab. Dieses
überraschende Ergebnis kann möglicherweise mit der Freisetzung der Parasiten
aus den Wirtszellen während der Differerenzierung der Schizonten zu Merozoiten
assoziiert sein. Die Charakterisierung der TaHSP90-Chr1 und TaHSP90-Chr4 Gen-
und Proteinformen wurde mittels molekularer Methoden sowie mit Hilfe
bioinformatischer Analysen durchgeführt. Eine Analyse der Phylogenie deutete
darauf hin, dass beide Isoformen mit dem HSP90 von Theileria annulata und
Babesia ovis näher verwandt sind als mit dem humanen bzw. dem bovinen HSP90.
Beide hier untersuchten Isoformen zeigten die Eigenschaften von HSP90, wie z.
B. die Anwesenheit einer ATP-Sequenz, die Anwesenheit einer funktionalen HSP-
Domäne sowie die Existenz einer Signal-Sequenz in der N-terminalen Sequenz.
Antigene Peptide wurden mit Hilfe der Internetseite „Predicting Antigenic
Peptides“ (http://imed.med.ucm.es /Tools/antigenic.pl) aus der Sequenz von
TaHSP90-Chr1 und TaHSP90-Chr4 abgeleitet. Die selektierten Peptide wurden
synthetisiert und genutzt, um zwei Kaninchen zu immunisieren. Leider erkannte
das anti-T. annulata HSP90-Antiserum das native HSP90 Protein nicht. In Bezug
auf das bovine HSP90 wurde eine Immunoblot-Färbung unter Verwendung des anti-
humanen HSP90α/β (HSP 90α/β (F-8): sc-13119, Santa Cruz) durchgeführt. Hier
wurde gezeigt, dass ein Antiserum gegen das humane HSP 90α/β das bovine HSP90
im Zelllysat detektieren kann. Darüber hinaus wurde die Spezifität dieses
Antikörpers nachgewiesen. Als alternative Methode für die Unterscheidung
zwischen dem Einfluss des bovinen und des T-annulata HSP90 wurde Novobiocin
herangezogen. Obwohl Novobiocin als spezifischer Inhibitor des bovinen HSP90
eingesetzt wird, zeigte sich nach der Behandlung mit Novobiocin jedoch, dass
auch die Parasiten starben. Ob Novobiocin jedoch einen direkten Einfluss auf
den Parasiten hat, oder dieser Effekt mit dem Tod der Wirtszellen
zusammenhängt, ist jedoch unklar. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der
vorliegenden Doktorarbeit, dass die Inaktivierung der Funktion von HSP90 durch
Geldanamycin zu Zellzyklusarrest, Apoptose und möglicherweise zur
Differenzierung der Schizonten zu Merozoiten in T. annulata Ankara
288-infizierten Wirtszellen führt.
de
dc.format.extent
XI, 134 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Theileria annulata
dc.subject
heat shock proteins
dc.subject
transformation
dc.subject
differentiation
dc.subject
chain reaction
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
The Role of Heat Shock Protein 90 (HSP90) in the Transformation of Theileria
annulata- infected Cells and the Parasite Stage Differentiation
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Jabbar S. Ahmed
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr . Hafez Mohamed Hafez
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Peter-Henning Clausen
dc.date.accepted
2015-08-06
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000100298-0
dc.title.translated
Die Rolle des Hitze-Schock-Proteins 90 (HSP90) in der Transformation von T.
annulata-infizierten Zellen und der Differenzierung von Parasiten-Stadien
de
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000100298
refubium.note.author
Mensch und Buch Verlag
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FUDISS_derivate_000000017841
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open access