Charakterisierung von humanen Satellitenzellen und deren Proliferationseigenschaften

Abstract

Satellitenzellen garantieren die Regeneration des Skelettmuskels bis ins hohe Alter. Diese Zellen sind genuine Muskelstammzellen und in einer besonderen anatomischen Nische lokalisiert, nämlich zwischen Basalmembran und Sarkolemma der einzelnen Muskelfaser. Auf Proteinebene sind diese Zellen durch Expression des Transkriptionsfaktors Pax7 sowie der Marker c-Met und CXCR4 charakterisiert, ein Wissen, das wir im Wesentlichen aus Mausmodellen erworben haben. Da sich besondere Hoffnungen an diese muskelspezifische Stammzellpopulation in Bezug auf Therapien von Muskeldystrophien oder Inaktivitäts - induzierte Muskelatrophie knüpfen, wurde in dieser Arbeit Charakterisierung und Differenzierung von humanen Muskelstammzellen erstmals systematisch untersucht. Aus der Hochschulambulanz für Muskelkrankheiten der Charité und durch eine Kooperation mit der Klinik für Orthopädie des HELIOS - Klinikums Berlin, Buch haben wir 24 Skelettmuskelproben erhalten, durch die eine Charakterisierung von humanen Muskelstammzellen vorgenommen werden konnte. Aus diesem Gewebe wurden Einzelfasern isoliert zur Darstellung von Satellitenzellen im physiologischen und anatomischen Kontext. Zur Durchführung dieser Isolation wurde eine Methode etabliert, die es erlaubte, humane Muskelfasern auf rein mechanische Weise zu gewinnen. Es wurden außerdem Einzelzellsuspensionen angefertigt zur Anfärbung nach Cytospin -Fixierung oder Weiterdifferenzierung in Kultur, sowie in Kryostatschnitten immunhistochemische Färbungen für Pax7, c-Met, CXCR4 und den Differenzierungsmarkern Myf5, MyoD, Myosin-Schwerekette (MHC), Myogenin und Desmin, durchgeführt. Pax7 konnte als zuverlässiger Marker einer Zellpopulation identifiziert werden, der Myonuclei in der Satellitenzellnische anfärbt, und wurde daher als Marker humaner Satellitenzellen bestätigt. Altersabhängig zeigte sich eine Abnahme des Anteils Pax7 - positiver Zellen mit einem Median von 3,597% in der Altersgruppe unter 50 Jahre auf einen Median von 2,239% in einer Altersgruppe über 70 Jahre. Wenn Muskelfasern im physiologischen Kontext kultiviert wurden, konnten aus Muskelfasern auch hochbetagter Donoren Satellitenzellen aktiviert werden und hunderte von Myoblasten auswachsen. Diese Zellen zeigten das komplette myogene Potenzial (Expression von MHC, Desmin). Die aus der Maus bekannten Satellitenzellmarker CXCR4 und c-Met haben im menschlichen Muskel keine durch Pax7 definierte Zellpopulation charakterisiert und sind zur Untersuchung humanen Materials ungeeignet. Es kann gefolgert werden, dass Skelettmuskel auch hochbetagter Probanden durch Satellitenzellen ein enormes Regenerationspotenzial besitzt. Humane Satellitenzellen müssen allerdings separat von Nagetier - Modellen betrachtet werden. Das Wissen um das Regenerationspotenzial von humanem Skelettmuskel kann Therapiekonzepte für Muskeldystrophien entscheidend beeinflussen.

Satellite cells guarantee the regeneration of skeletal muscle until old age. They are genuine muscle stem cells that are localized in a characteristic anatomic localization between basal lamina and sarkolemma of each muscle fiber. On protein level they are characterized by their expression of the transcription factor Pax7 and different other markers like c-Met and CXCR4. Most of our knowledge is based on studies with mouse models. Due to their availability and remarkable capacity to regenerate damaged muscle, satellite cells are considered potential candidates for cell-based therapies to treat muscular dystrophies and other neuromuscular diseases. To improve our knowledge about those muscle stem cells, human satellite cells were first systematically characterized in this study. We obtained 24 muscle samples from the ambulance for muscle diseases at Charité, Berlin and due to a cooperation with the orthopaedic department of HELIOS - Klinikum Berlin, Buch. Immediately after surgery, single muscle fibers were primed to extract satellite cells in their typical anatomical localization. In difference to well known enzymatic methods to isolate single muscle fibres we established a method with just a mechanical preparation. Also, we worked with cell suspensions and cryo muscle sections of human muscle and cell culture to observe the differentiation of satellite cells into mature myotubes. To investigate the expression of human muscle stem cell markers, immunohistochemistry was performed for Pax7, c-Met, CXCR4, differentiation markers like Myf5, MyoD, Myosin – heavy – chain, Myogenin and Desmin. Pax7 was shown to be the most potent marker to identify satellite cells in their anatomical niche. The amount of satellite cells in percent decreases with age from a median of 3,597% in patients younger than 50 years to a median of 2,239% in patients older than 70 years. Culturing human muscle fibres showed that satellite cells from older patients were also able to give rise to newly formed myoblasts which contain the whole myogenic potential of regeneration (expression of Desmin and MHC). In difference to the knowledge of murine models satellite cell markers c-Met and CXCR4 did not show a coexpression with our satellite cell marker Pax7 and are not suitable for characterising human muscle material. It can be reasoned, that human satellite cells of older patients possess the same regeneration potential as satellite cells of younger probands. But it is important to examine human satellite cells separately to murine satellite cells since first differences were shown. It is important to learn about the regeneration potential in human satellite cells since this knowledge can have an impact of future therapy concepts in treating muscle disease.