Entwicklung eines in vitro-Kokultur-Modells zur Untersuchung der Interaktion von intestinalen Epithelzellen und Makrophagen bei Salmonellosen

Abstract

Einleitung: Salmonellosen stellen die häufigsten meldepflichtigen Infektionskrankheiten in Deutschland dar. Überträger sind hauptsächlich Nutztiere bzw. die aus ihnen hergestellten Lebensmittel, die im Menschen zu akuten Diarrhoen führen. Zur Eindämmung dieser Infektionskrankheit sind neue Prophylaktika zur Behandlung der Tiere wünschenswert. Zwar gelten in vivo-Experimente als der Goldstandard zur Erforschung von Medikamenten, sie sind jedoch kostenintensiv und im Sinne des Tierschutzes auf ein Mindestmaß zu reduzieren. In vitro-Systeme stellen deshalb für die Testung von Wirkstoffen eine gute Alternative dar. Intestinale Solitärkulturen bilden hier lediglich die Interaktion der Pathogene mit den Darmepithelzellen ab. Salmonellen besitzen die Möglichkeit, die Barriere direkt durch die Dysregulation des interzellulären TJ-Netzwerks zu kompromittieren, können diese jedoch auch indirekt durch Zytokinausschüttung stören. Produzenten proinflammatorischer Zytokine sind überwiegend die subepithelialen Immunzellen, u.a. Makrophagen. Um diese komplexen Interaktionen zwischen Epithel- und Immunzellen abzubilden, ergibt sich die Notwendigkeit zur Etablierung eines Kokultursystems. Methoden: PBM-Zellen wurden differenziert, unter Verwendung verschiedener Nährmedien kultiviert oder kokultiviert und mittels FACS-Analyse auf makrophagentypische Oberflächenmarker untersucht. Daraufhin wurden solitär- und kokultivierte IPEC-J2-Zellen hinsichtlich ihres TERs, Fluorescein-Fluxes und ihrer TJ-Proteinlokalisation und -expression mit und ohne S. Typhimurium bzw. deren verschiedener Bestandteile oder Mutanten untersucht. Darüber hinaus wurde Pralnacasan an IPEC-J2 und Caco-2bbe-Zellen, Quercetin an IPEC-J2-Zellen unter Betrachtung des TERs und des Fluorescein-Fluxes als potentielle Wirkstoffe gegen die S. Typhimurium verursachten Barrierestörungen getestet. Ergebnisse: Optimale Kultivierungsbedingungen konnten erreicht werden, indem die PBM-Zellen in IMDMFCS zu Makrophagen differenziert und anschließend in DMEMPIGS mit IPEC-J2-Zellen kokultiviert wurden. Nicht infizierte Solitär- und Kokulturen wiesen stabile TER-Werte und ein regelhaftes Claudin-4-Netz auf. In Solitärkulturen führte nur die Infektion mittels invasiver S. Typhimurium-Varianten zu einem TER-Abfall. Dabei wiesen infizierte Solitärkulturen neben eines reduzierten TERs eine Umverteilung von Claudin-4 und zum Teil erhöhte Fluorescein-Fluxe auf. Infizierte Kokulturen zeigten dagegen einen stärkeren Abfall des TERs, höhere Fluorescein-Fluxe und eine ausgeprägtere Umverteilung von Claudin-4. Zu einer partiellen Wiederherstellung des TERs und Fluorescein-Fluxes infizierter Solitärkulturen führten Pralnacasan in Caco-2bbe-Zellen und Quercetin in IPEC-J2-Zellen. Zusammenfassung: Die etablierte Kokultur ist geeignet, die Interaktion zwischen Makrophagen und Darmepithelzellen bei S. Typhimurium-Infektion abzubilden. Zudem weisen Pralancasan in Caco-2bbe- und Quercetin in IPEC-J2-Zellen ein protektives Potential gegen S. Typhimurium-Infektionen auf.

Indroduction: Salmonelloses represent the most common notifiable infectious disease in Germany. Carriers are mainly farm animals or the food produced from them which lead to acute diarrhea in humans. To reduce this infection new prophylactic agents are desirable for the treatment of animals. While in vivo experiments are considered to be the gold standard for drug discovery they are costly and need to be minimized for animal welfare purposes. In vitro systems therefore represent a good alternative for the testing of chemical agents. Intestinal solitary cultures here only represent the interaction of the pathogens with the intestinal epithelial cells. Salmonella has the potential to compromise the barrier directly through dysregulation of the intercellular TJ network but may also interfere with it indirectly through cytokine secretion. Producers of proinflammatory cytokines are predominantly the subepithelial immune cells, e.g. macrophages. In order to map these complex interactions between epithelial and immune cells, there is a need to establish a co-culture system. Methods: PBM cells were differentiated, cultured or co-cultured using different nutrient media and examined afterwards for macrophage-specific surface markers using FACS analysis. Subsequently, fluorescein fluxes, TJ protein localization and expression where studied in solitary and co-cultured IPEC-J2 cells with and without infection of S. Typhimurium, its components or mutants. In addition, the chemical agents pralnacasan, examined in IPEC-J2 and Caco-2bbe cells, and quercetin, examined in IPEC-J2 cells, were tested for their protective potential against S. Typhimurium-induced barrier disruption. Results: optimal culture conditions could be achieved when PBM-cells where differentiated to macrophages in IMDMFCS and afterwards co-cultured with IPEC-J2 cells in DMEMPIGS. Not infected solitaire- and co-culture showed stable TER values and a defined claudin-4 network. In solitaire culture infection only with invasive S. Typhimurium types showed a decrease in TER. In addition to the TER decrease the infected IPEC-J2 solitaire cultures showed a redistribution of claudin-4 and in some cases an increased fluorescein flux. The infected IPEC-J2 cocultures showed an increased reduction in TER, higher fluorescein flux and an even more pronounced redistribution of claudin-4 than their solitaire cultures counterparts. In infected solitaire cultures a partial TER rescue and reduced fluorescein flux could be archived using pralnacasan in Caco-2bbe cells and quercetin in IPEC-J2 cells. Conclusions: The established coculture is adequate to investigate the interaction between macrophages and intestinal epithelial cells after S. Typhimurium infection. Pralnacasan and quercetin showed a protective potential against S. Typhimurium infection in Caco-2bbe and IPEC-J2 cells, respectively.