Expansion of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) in 3D bioreactors for extracorporeal liver support

Abstract

Acute liver failure (ALF) is a life-threatening condition, which to date can only be treated by supportive care or liver transplantation. The use of hiPSC-derived hepatocyte-like cells (HLCs) offers a promising therapeutic alternative which, however, requires sufficient hiPSC quantities at high cell quality and purity. Therefore, the aim of the first part of this thesis was to investigate the expansion of hiPSCs in perfusion-based, 3D hollow-fiber bioreactors combined with non-invasive online monitoring of oxygen for culture surveillance. The first study examines the effect of the initial cell density on the quantitative and qualitative expansion outcome. Analysis of the expansion rates, which were determined by cell counting and performing the CellTiter-Blueâ Assay, revealed a more than 100-fold expansion at low initial cell densities (2,9 - 3,3 x 106 cells/mL) compared to a 28-fold expansion at higher initial cell densities (16,6 x 106 cells/mL). Furthermore, a higher rate of spontaneous cell differentiation occurred in bioreactors inoculated with higher cell densities. To conclude, lower initial cell densities in the range of 3 x 106 cells/mL lead to better quantitative and qualitative expansion results compared to higher initial cell densities. In the second study, the use of continuous measurement of oxygen for online culture control was evaluated. Calculated oxygen uptake rates (OURs), glucose consumption rates (GCRs) and lactate production rates (LPRs) revealed a highly significant correlation (p < 0.0001), indicating that oxygen is equivalent to glucose as parameter for hiPSC expansion while providing an accurate real-time monitoring of the hiPSC culture development. As a result of both studies, the conditions for an optimized expansion of hiPSCs in 3D bioreactors under continuous online surveillance of oxygen were successfully established. Subject of the second part of this thesis were basic studies on the co-cultivation of hiPSCs with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) for an improvement of the hepatic differentiation of hiPSCs. The study was aimed at determining a medium composition supporting both, the hepatic differentiation of hiPSCs as well as the maintenance of co-cultured HUVECs. The results revealed that a mixture of hepatocyte culture medium (HCM) and endothelial growth medium (EGM) at a 1:1 ratio, as well as a mixture of HCM and EGM supplements (without the base medium) supported the maintenance of HUVEC cultures. Thus, suitable medium compositions for following experiments on co-cultures of hiPSCs and HUVECs were successfully identified.

Akutes Leberversagen führt zu einem lebensbedrohlichen klinischen Zustand; therapeutische Möglichkeiten sind derzeit limitiert auf unterstützende Verfahren und die Lebertransplantation als Ultima Ratio. Die Verwendung von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gebildeten Hepatozyten, sog. hepatocyte-like cells (HLCs), stellt eine vielversprechende therapeutische Alternative dar, für die jedoch ausreichende Zellmengen in hoher Qualität und Reinheit benötigt werden. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war es, die Expansion von hiPSCs in perfusionsbasierten 3DHohlfaser-Bioreaktoren in Kombination mit einem nicht-invasiven Online-Monitoring-Verfahren von Sauerstoff zur Kulturüberwachung zu untersuchen. Die erste Studie beschäftigt sich mit dem Einfluss der initialen Zelldichte auf das quantitative sowie qualitative Expansionsergebnis. Die Analyse der Expansionsraten, ermittelt durch Zellzählung und den CellTiter-Blueâ Assay, ergab eine mehr als 100-fache Expansion in Bioreaktoren mit einer geringeren initialen Zelldichte (2,9 - 3,3 x 106 Zellen/mL). Bioreaktoren, die mit einer höheren Zellzahl befüllt wurden (16,6 x 106 Zellen/mL), zeigten hingegen nur eine 28-fache Expansion. Außerdem wurde anhand von Genexpressionsanalysen und immunhistologischen Untersuchungen in diesen Bioreaktoren auch eine höhere Rate einer spontanen, ungezielten Differenzierung festgestellt. Aus den Ergebnissen lässt sich schließen, dass eine eher geringe Zelldichte im Bereich von 3 x 106 Zellen/mL sowohl quantitativ als auch qualitativ zu besseren Expansionsergebnissen als eine höhere Zelldichte führt. In der zweiten Studie wurde die Verwendung einer kontinuierlichen Sauerstoffmessung zur engmaschigen Überwachung des Expansionsprozesses untersucht. Die errechneten Sauerstoffaufnahmeraten (OURs), Glukoseverbrauchsraten (GCRs) und Laktatproduktionsraten (LPRs) zeigten eine hoch signifikante Korrelation (p < 0.0001) und wiesen somit darauf hin, dass Sauerstoff in gleichem Maße wie Glukose zum Monitoring der hiPSC-Expansion in dem untersuchten Bioreaktorsystem geeignet ist, jedoch mit dem zusätzlichen Vorteil, die Kulturentwicklung in Echtzeit darzustellen. Mit diesen beiden Studien wurden erfolgreich die Bedingungen für eine optimierte Expansion von hiPSCs in 3D-Bioreaktoren unter kontinuierlicher Online-Sauerstoffüberwachung etabliert. Inhalt des zweiten Teils dieser Arbeit waren grundlegende Untersuchungen zu einer Verbesserung der leberspezifischen Funktionen von HLCs durch Kokultur mit human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Ziel war es, eine Mediumzusammensetzung zu ermitteln, die sowohl die hepatische Differenzierung der hiPSCs, als auch den Erhalt der kokultivierten HUVECs unterstützt. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl eine Mischung aus hepatocyte culture medium (HCM) und endothelial growth medium (EGM) in einem 1:1-Verhältnis, als auch eine Mischung aus HCM und EGM-Zusätzen (ohne das EGM Basalmedium) für die HUVEC-Kultur geeignet sind. Damit wurden erfolgreich geeignete Mediumzusammensetzungen für nachfolgende Experimente zur Kokultur von hiPSCs mit HUVECs identifiziert.