Enhancing engineered vascular networks in vitro and in vivo using stem cells and growth factors

Abstract

Introduction Creating functional vasculature remains one important goal to improve or restore human tissue function in disease or after trauma. However, mechanisms and pleotropic effects involved, especially with regard to osteogenic regeneration, remain poorly understood. We here hypothesized, that angiogenic human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) combined with stabilizing, proangiogenic properties of multipotent mesenchymal stem cells (MSC) might enhance vascular network formation. Using different in vitro and in vivo models, we here addressed aspects of vasculogenesis, vascular functionality and network formation in the context of bone formation. Methods We developed two vascularization protocols, one for angiogenesis in a collagen-fibronectin matrix using MSC and HUVEC and one for vascularizing bone grafts using additionally pre-induced and non-induced MSC from human bone marrow. We then tested the impact of recombinant insulin-like growth factor 1 (IGF1) protein and IGF1 expressing HEK293 cells upon vasculogenesis in vitro and as subcutaneous implants within immunodeficient mice to investigate anastomoses with the host vessels and functionality. Subsequently we performed morphometric analysis. Thereafter, we harvested bone marrow stromal cells from alpha-smooth muscle actin GFP (α-SMA-GFP) transgenic mice, sorted them by Fluorescence-activated cell sorting (FACS) and applied 3D cell culture model to test their ability to support vascularization. Results Endothelial cells formed stable vascular networks in vitro and throughout bone scaffolds implanted into NOD SCID mice, when co-cultured with MSC (p < 0.05 vs. controls, Objective 1). MSC induced with osteogenic medium showed enhanced bone formation and mineralization after 8 weeks as evidenced by van Kossa and Alizarin red staining (Objective 2). We significantly enhanced de novo vasculogenesis in vitro and in vivo by using IGF1 (p < 0.05, Objective 3). Anastomosis occurred by day 11 as visualized by fluorescent labeling of cells and by visualization of blood flow using Quantum dots thereby proving functionality of the engineered vascular networks (Objective 4). α-SMA-GFP positive cells were confirmed as a subpopulation of pericytes that stimulated tube-formation of endothelial cells (Objective 5). Conclusion Our data provide first evidence that the use of cellular components yields higher-quality grafts and enables perfusion within the bone scaffolds upon anastomosis. Furthermore, the use of MSC differentiated into vascular lineages results in longer lasting, viable autologous vascularized bone grafts, and osteogenic induction of MSC enhances bone formation and mineralization within the scaffold. Moreover, we were able to show that IGF1 further enhances engineered capillary-like vasculature, which we attribute to its pleiotropic effects, and by visualizing blood flow in a SCID mouse model in vivo through the anastomosed host and graft vessels we were able to testify the functionality of anastomoses and engineered vessels. Finally, we were able to further characterize the relation of MSC and pericytes. The strategies combined suggest a promising approach to engineer de novo vasculature to support tissue regeneration. Confirmatory future experiments are urgently needed with a focus on vascular remodeling and long-term results of engineered vessels.

Die Züchtung funktionsfähiger Gefäße aus patienteneigenen Stammzellen und Endothelzellen scheint essentiell, um menschliche Gewebsfunktion nach Unfällen oder infolge von Krankheiten zu verbessern oder wiederherzustellen. Jedoch sind zugrundeliegende Mechanismen und pleiotrope Effekte, insbesondere im Kontext der Knochenregeneration, unzureichend verstanden. Wir postulieren, dass die Kombination menschlicher gefäßbildender Endothelzellen der Umbilikalvene (HUVEC) mit multipotenten, mesenchymalen Stammzellen (MSC) die Bildung kapillarähnlicher Gefäße verbessern kann. Im vorliegenden Manuskript diskutieren wir anhand von in vitro und in vivo durchgeführten Versuchsreihen verschiedene Aspekte der Vaskulogenese, der Funktionalität gezüchteter Gefäße auch hinsichtlich der Knochenregeneration. Methoden Zunächst etablierten wir zwei Vaskularisierungs-Protokolle. Im ersten Modell kombinierten wir eine kollagen-fibrogenhaltige Matrix mit MSC und HUVEC, im zweiten Modell setzen wir zusätzlich osteogen induzierte MSC von Knochenmarksspenden ein, um die Bildung vaskularisierter Knochentransplantate zu simulieren. Wir testeten dann den Einfluss rekombinanten insulin-like growth factor 1 (IGF1) Proteins sowie einer IGF1 exprimierenden HEK293 Zelllinie auf die Vaskulogenese in vitro und als subkutane Implantate in einem NOD SCID Mausmodell, um die Anastomosenbildung mit den Wirtsgefäßen und ihre Funktionsfähigkeit zu untersuchen, die wir anschließend morphometrisch analysierten. Zusätzlich wurden Stromazellen des Knochenmarks alpha-smooth muscle actin GFP (α- SMA-GFP) positiver transgener Mäuse gewonnen, mittels Fluorescence-activated cell sorting (FACS) sortiert und in einem dreidimensionalen Zellkultur-Modell bezüglich ihrer Effekte auf die Gefäßneubildung untersucht. Ergebnisse Die Endothelzellen bildeten stabile, dichte kapillarähnliche Netzwerke in vitro und in der gesamten subkutan implantierten, zellbeschickten Knochenmatrix im NOD SCID Mausmodell im Gegensatz zur Kontrollgruppe unter Standardbedingungen (p < 0.05 vs. Kontrollgruppen, Zielstellung 1). Induzierte MSC verbesserten die Knochenbildung und -mineralisierung nach 8 Wochen, wie wir histologisch mittels van Kossa und Alizarinrotfärbung zeigen konnten (Zielstellung 2). Die Anreicherung mit IGF1 verbesserte die de novo Vaskulogenese signifikant in vitro und in vivo (p < 0.05, Zielstellung 3). Anastomosenbildung begann ab Tag 11, wie anhand von Fluoreszenzfärbungen der Zellen gezeigt werden konnte. Durch Visualisierung des Blutflusses mittels Quantum dots konnten wir auch die Funktionalität der gezüchteten vaskulären Netzwerke bestätigen (Zielstellung 4). Darüberhinaus konnten wir α-SMAGFP positive Zellen als Subpopulation von Perizyten nachweisen (Zielstellung 5). Diskussion Die Strategien in Kombination zeigen einen vielversprechenden Ansatz auf, die de novo Züchtung von Blutgefäßen zu verbessern, um die Regeneration von funktionellem Gewebe zu unterstützen. Zukünftige Experimente sollten die Langzeiteffekte und Re-Modellierung gezüchteter Gefäße untersuchen.