The symbioses of termite gut flagellates and their bacterial endo- and ectosymbionts: analysis of ultrastructure, phylogeny, and cospeciation

Abstract

The complex mechanisms leading to a tripartite symbiosis involving bacteria, flagellates, and host termites are not yet fully understood. While the flagellates are known to play a major role in the degradation of the cellulosic food of the termites, in most cases, the functions of the diverse flagellate-associated bacteria are completely obscure. Unambiguous identification of the mostly uncultivable prokaryotes and eukaryotes is an important step in understanding the mutual interactions between the two partners. For this purpose, in the studies described in my thesis, morphological investigations (light microscopy and electron microscopy) were combined with molecular phylogenetic analyses (full-cycle-rRNA approach). In two earlier light microscopy studies, other authors reported contradicting numbers of devescovinid flagellates occurring in the hindgut of the dry-wood termite Incisitermes marginipennis. We clearly and unambiguously documented the presence of only one devescovinid species (Metadevescovina modica) inhabiting the gut of I. marginipennis using a combination of various light and electron microscopy techniques and molecular phylogenetic analysis of the small subunit (SSU) rRNA gene sequences. Moreover, we confirmed the validity of the genus Metadevescovina, which had long been discussed as being the same as the genus Devescovina; monophyly of each of the genera was revealed by molecular phylogenetic analyses. Metadevescovina could not be distinguished from Devescovina solely by morphological characteristics of the flagellates themselves, but the two flagellate genera could be differentiated by examining their bacterial symbionts. The cell surface of Metadevescovina flagellates is densely colonized with spirochetes, and that of Devescovina flagellates is densely covered with filamentous bacteria affiliated to the Bacteroidales. Molecular phylogenetic analyses of Devescovina spp. and their bacterial symbionts from a wide range of Kalotermitidae revealed that the termites acquired two bacterial symbionts by two different routes: vertical transmission and horizontal transmission. The ectosymbionts of Devescovina spp. form a monophyletic group within the Bacteroidales (“Candidatus Armantifilum devescovinae”). Congruence analyses of the phylogenetic trees of Devescovina spp. and “Candidatus Armantifilum devescovinae” documented a strict cospeciation of the partners, which indicated an obligate symbiosis, leading to a vertical transmission of the bacteria within their host lineages. The ‘Endomicrobia’ endosymbionts of Devescovina spp. are most closely related to endosymbionts of phylogenetically unrelated termite gut flagellates, which indicated that these symbionts were acquired by horizontal transmission between different flagellate species present in the same termite gut. In a further study documented in this thesis, the multiple symbionts of the flagellate Joenia annectens from the dry-wood termite Kalotermes flavicollis were identified, localized using a full-cycle-rRNA approach, and morphologically described at the ultrastructural level. Two populations of J. annectens could be distinguished not only by their SSU rRNA gene sequences (0.8% sequence divergence), but also by differences in their assemblages of bacterial symbionts. Each of the flagellate populations hosted phylogenetically distinct ectosymbionts from the phylum Bacteroidetes, while a single phylotype of ‘Endomicrobia’ was consistently associated with only one of the host phylotypes. However, not all individuals were colonized, once again corroborating that ‘Endomicrobia’ are not always cospeciating with their host lineages. The results reported in my thesis provide important information about the specificity of the symbioses between termite gut flagellates and their bacterial symbionts. This information is necessary for further studies of the function of these symbioses. A possible involvement of bacterial symbionts in the nitrogen metabolism of the host flagellates is discussed.

Die komplexen Mechanismen, welche der Dreiersymbiose zwischen Bakterien, Flagellaten und ihren Wirtstermiten zugrundeliegen, sind bis heute noch weitgehend unverstanden. Während den Flagellaten eine wesentliche Rolle beim Abbau der cellulosehaltigen Nahrung der Termiten zugeschrieben wird, sind die Funktionen der diversen, mit den Flagellaten assoziierten Bakterien in den meisten Fällen komplett unbekannt. Ein wichtiger Schritt für die Erforschung der wechselseitigen Beziehungen zwischen den in der Regel nicht kultivierbaren pro- und eukaryotischen Symbionten stellt deren eindeutige Identifizierung dar. Dazu wurden in den vorliegenden Studien morphologische Untersuchungen (Licht- und Elektronenmikroskopie) beider Partner mit molekular- phylogenetischen Analysen kombiniert (full-cycle-rRNA approach). In zwei vorangegangenen lichtmikroskopischen Studien anderer Autoren wurde für die Trockenholztermite Incisitermes marginipennis eine widersprüchliche Artenanzahl von devescoviniden Flagellaten dokumentiert. Durch den Einsatz verschiedener licht- und elektronenmikroskopischer Techniken sowie durch die Analyse der Sequenzvariabilität der Gene der kleinen ribosomalen Untereinheit (SSU rRNA) konnten wir in der vorliegenden Arbeit eindeutig zeigen, dass I. marginipennis lediglich eine Art devescovinider Flagellaten (Metadevescovina modica) im Darm beherbergt. Gleichzeitig konnten wir die Gültigkeit der Gattung Metadevescovina, welche bis zum heutigen Tag stark umstritten war und häufig als Synonym zu Devescovina angesehen wurde, bestätigen. Molekularphylogenetische Analysen zeigten, dass beide Gattungen jeweils eine separate monophyletische Gruppe bilden. Eine Unterscheidung der beiden Gattungen an Hand morphologischer Merkmale der Flagellaten selbst war nicht möglich, konnte jedoch unter Berücksichtigung ihrer bakteriellen Symbionten erfolgen. Während Flagellaten der Gattung Metadevescovina einen dichten Besatz von Spirochaeten auf ihrer Oberfläche zeigen, sind Devescovina spp. vollständig von filamentösen Bakterien bedeckt, welche den Bacteroidales zugeordnet werden. Molekularphylogenetische Analysen von Devescovina spp. von verschiedenen Vertretern der Kalotermitidae und ihren bakteriellen Symbionten ergaben zwei verschiedene Szenarien bezüglich des Erwerbs dieser Symbionten: Eine vertikale Weitergabe und eine horizontale Weitergabe. Es konnte gezeigt werden, dass die Ektosymbionten eine monophyletische Gruppe innerhalb der Bacteroidales bilden („Candidatus Armantifilum devescovinae“). Kongruenzanalysen der Stammbäume von Devescovina spp. und „Candidatus Armantifilum devescovinae“ dokumentierten eine strikte Kospeziation der Partner. Eine obligate Symbiose der beiden Partner, und somit eine vertikale Weitergabe der Bakterien innerhalb ihrer Wirtsflagellaten, konnte demnach belegt werden. Der Erwerb von Symbionten durch horizontale Weitergabe von anderen Wirtsflagellaten wurde dagegen für die im Zytoplasma vorkommenden ‚Endomicrobia‘ dokumentiert. Hier waren die nächsten Verwandten der mit den Devescovina spp. assoziierten ‚Endomicrobia‘ Endosymbionten von phylogenetisch nicht verwandten Termitenflagellaten. In einer weiteren Studie dieser Arbeit wurden die multiplen Symbionten des Flagellaten Joenia annectens aus der Trockenholztermite Kalotermes flavicollis identifiziert und lokalisiert (full- cycle-rRNA approach). Ultrastrukturelle Untersuchungen ermöglichten eine morphologische Beschreibung der gefundenen Phylotypen. Basierend auf den Assoziationen mit phylogenetisch verschiedenen Symbionten konnten zwei Populationen von J. annectens unterschieden werden. Gestützt wurde das Ergebnis durch die Analyse der SSU rRNA Gensequenzen von J. annectens (0,8% Sequenzunterschied zwischen beiden Populationen). Beide Flagellatenpopulationen waren jeweils mit eigenen Ektosymbionten des Phylums Bacteroidetes assoziiert. Dahingegen beherbergte nur eine der beiden Populationen von J. annectens einen Vertreter der ‚Endomicrobia‘ im Zytoplasma. Das Fehlen von ‚Endomicrobia‘-Symbionten bei vielen Flagellaten der gleichen Population zeigt ein weiteres Beispiel dafür, dass diese Symbionten nicht immer mit ihren Wirtsflagellaten kospeziieren. Die Ergebnisse meiner Arbeit haben wichtige Erkenntnisse zur Spezifität der Symbiosen zwischen Termitenflagellaten und ihrer bakteriellen Symbionten gebracht. Sie stellen somit eine Grundvoraussetzung für die anstehende Erforschung der funktionellen Aspekte dieser Symbiosen dar. Eine Beteiligung der bakteriellen Symbionten am Stickstoffstoffwechsel der Flagellaten wird diskutiert.