Die Rolle zellulärer Stressantworten bei der Chemoresistenz gegenüber 5-Fluorurazil

Abstract

Resistenzen gegenüber Chemotherapeutika schränken die Effektivität der Chemo- therapie bei Krebserkrankungen häufig stark ein. Daher ist die Aufklärung der Mechanismen, die zur Ausbildung solcher Resistenzen führen, von großer Bedeutung. Hierzu wird vor allem die Bäckerhefe S. cerevisiae eingesetzt, da sie sich aufgrund ihrer Homologie zum Menschen und ihrer simplen Genetik hervorragend zur Untersuchung von Resistenzwegen eignet. Deshalb war es das Ziel, zunächst in einer globalen Analyse Gene zu identifizieren, die eine Resistenz gegenüber 5-Fluorurazil (5-FU) vermitteln, das als Standardtherapie bei verschiedenen soliden Tumoren eingesetzt wird. In dieser Analyse wurden 65 5 FU-sensitive Deletionsstämme identifiziert, von denen 27 bereits publiziert worden sind. Die identifizierten Gene sind vor allem in die RNA-Prozessierung und Translation involviert. Darüber hinaus wurden auch Deletionsstämme identifiziert, die für Komponenten von Stress-granules (SGs) oder P bodies (PBs) defizient sind. Außerdem ließ sich zeigen, dass 5-FU in Hefezellen die de novo-Bildung von SGs induziert. Des Weiteren wurde die PB-Bildung durch 5-FU verstärkt. Diese Beobachtungen in Hefezellen ließen sich auch in humanen Zellen bestätigen. So zeigten auch 5-FU-behandelte HeLa-Zellen eine de novo- Bildung von SGs, die zentrale Markerproteine von bona fide SGs enthielten. Darüber hinaus wurde die SG-Bildung unter Stressbedingungen sowie die Bildung von PBs durch 5 FU verstärkt. Die SG-Induktion ging mit der Phosphorylierung von eIF2α einher und ließ sich auch in weiteren Zelllinien aufzeigen. Da die 5 -FU-induzierten SGs außerdem den Apoptose-Regulator RACK1 rekrutierten, könnten sie sich zytoprotektiv auswirken und den toxischen Effekten von 5 FU entgegenwirken. Eine weitergehende Charakterisierung der 5-FU-induzierten SGs zeigte, dass diese sehr beständig waren und sich daher über einen langen Zeitraum hinweg nicht auflösten. Damit einhergehend wiesen sie eine sehr dichte Ultrastruktur auf. Zudem war die Sensitivität von Zellen gegenüber 5-FU durch die Bildung von SGs verringert, was auf eine Rolle der SGs bei der Resistenz gegenüber 5-FU hindeutet. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Inkorporation von 5-FU in RNA verantwortlich ist für die Induktion von SGs. Dementsprechend lösten auch andere RNA-inkorporierende chemotherapeutische Substanzen wie Azacytidin oder Thioguanin die SG-Bildung aus. Hingegen führten Chemotherapeutika wie Trifluor-thymidin oder Gemzitabin, die hauptsächlich in DNA eingebaut werden, zu einer vermehrten PB-Bildung. Gemzitabin wird oft in Kombinationstherapie mit 5-FU eingesetzt. Obwohl Gemzitabin allein keinen Einfluss auf SGs hatte, wurde hingegen in Kombination mit 5-FU die SG-Bildung verstärkt. Außerdem verstärkte 5-FU unter Stressbedingungen auch die Bildung von nukleären Stress-bodies (nSBs), die den Hitzeschockfaktor HSF1 enthalten. Es konnte zudem gezeigt werden, dass HSF1 ein negativer Regulator der SG- und PB-Bildung ist und somit auch die Auswirkungen von 5-FU auf SGs und PBs beeinflusst, was wiederum eine Bedeutung von HSF1 für die Chemoresistenz nahelegt. Sowohl die Induktion von SGs als auch die vermehrte Bildung von PBs und nSBs durch 5-FU könnten protektive Mechanismen darstellen, die das Überleben von Krebszellen bei der Chemotherapie ermöglichen und so derer Wirksamkeit einschränken. Weitere Untersuchungen der zellulären Prozesse könnten somit potentielle Ziele für eine effektivere Therapie aufdecken.

Resistance to chemotherapeutic agents often severely limits the efficiency of chemo-therapy for cancer. Therefore, the elucidation of mechanisms leading to the development of such chemoresistance is of great importance. For this, the baker's yeast S. cerevisiae is primarily used because it is excellently suited to study resistance pathways due to its homology to human and its simple genetics. Therefore, the goal was to first identify in a global analysis genes which confer resistance to 5-fluorouracil (5-FU), which is used as standard therapy in various solid tumors. In this analysis, 65 5-FU-sensitive deletion strains were identified, of which 27 have already been published. The genes identified are involved mainly in RNA processing and translation. In addition, deletion strains deficient for components of stress granules (SGs) or P bodies (PBs) were identified. Besides that, it was demonstrated that 5-FU induces the de novo formation of SGs in yeast cells. Moreover, the PB formation was enhanced by 5-FU. These observations in yeast cells could also be confirmed in human cells. 5-FU-treated HeLa cells exhibited the de novo formation of SGs containing central marker proteins of bona fide SGs. In addition, the SG formation under stress conditions as well as the formation of PBs was enhanced by 5-FU. The SG induction was accompanied by the phosphorylation of eIF2α and was also demonstrated in other cell lines. Since the 5 FU-induced SGs also recruited the apoptotic regulator RACK1, they could be cytoprotective and thus counteract the toxic effects of 5-FU. A further characterization of the 5-FU- induced SGs showed that they were very durable and thus did not dissolve over a long time period. Concomitantly, they exhibited a very dense ultrastructure. In addition, the sensitivity of cells to 5-FU was reduced by the formation of SGs, suggesting a role of SGs in the resistance to 5-FU. Furthermore, it was shown that the incorporation of 5-FU into RNA is responsible for the induction of SGs. Accordingly, other RNA-incorporated chemotherapeutic agents such as azacytidine or thioguanine induced SG formation. However, chemothera-peutics such as trifluorothymidine or gemcitabine, mainly incorporated into DNA, led to increased PB formation. Gemcitabine is often used in combination therapy with 5-FU. Although gemcitabine alone had no effect SGs, the formation of SGs was enhanced in combination with 5-FU. In addition, under stress conditions 5-FU also increased the formation of nuclear stress bodies (nSBs) containing the heat shock factor HSF1. It could also be demonstrated that HSF1 is a negative regulator of SG and PB formation and thus also modulates the effects of 5-FU on SGs and PBs, suggesting a role of HSF1 in chemoresistance. Both the induction of SGs by 5-FU and the increased formation of PBs as well as nSBs could represent protective mechanisms allowing the survival of cancer cells during chemotherapy and thereby restricting its efficiency. Further investigation into these cellular processes could thus reveal potential targets for more effective therapy.