Phänotypisierung der alternden Clca1-Knockout-Maus

Abstract

Die CLCA-Proteinfamilie (engl. chloride channel regulators, calcium-activated) ist seit mehreren Jahrzenten Forschungsschwerpunkt verschiedener Arbeitsgruppen weltweit. Sie umfasst komplexe, hochkonservierte Proteine mit einem weiten, Spezies-spezifischen Expressionsmuster. Vor allem das CLCA1-Protein, welches von Mukus-produzierenden Zellen insbesondere des Respirations- und Intestinaltraktes synthetisiert und vollständig sezerniert wird, scheint beim Menschen und bei der Maus pleiotrope, wenn auch bislang nicht vollständig erforschte Funktionen aufzuweisen und konnte mit relevanten, Mukus-assoziierten, humanmedizinischen Erkrankungen wie der zystischen Fibrose (Mukoviszidose), dem Asthma oder der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung in Verbindung gebracht werden. In jüngst publizierten Studien wurden für das CLCA1-Protein vor allem Funktionen als Mukusprozessor, Immunmodulator und Tumorsuppressor hypothetisiert. In zunehmendem Maße stellen genetisch-veränderte Mauslinien exzellente Modelle für humanmedizinische Erkrankungen, stets unter Beachtung der komplexen Speziesunterschiede, dar. So wurden auch für das Clca1-Gen Knockout-Modelle generiert und bisher für vorrangig inflammatorische Fragestellungen eingesetzt. In naiven, spezifiziert pathogenfreien Clca1-Knockout-Mäusen (hier: Clca1-/-) konnte bis zu einem Alter von neun Monaten bislang kein Phänotyp beschrieben werden. In bakteriell und chemisch induzierten Entzündungsmodellen der Lunge, des Darms und der Gelenke zeigte die adulte Clca1-/--Maus in einem Alter von bis zu 16 Wochen einen immunmodulatorischen Phänotyp. Ältere Mäuse entwickeln jedoch über ihre Lebenszeit eine Reihe pathophysiologischer Veränderungen, wie z.B. Tumore sowie entzündlichen oder degenerativen Erkrankungen als Teil des natürlichen Alterungsprozesses. Bisher ist über die Rolle des CLCA1-Proteins im Prozess des Alterns und der damit einhergehenden Entwicklung von alterstypischen, pathologischen Veränderungen nichts bekannt. Ziel dieser Studie war es daher, die Auswirkungen des Fehlens von CLCA1 auf den Alterungsprozess von Mäusen zu untersuchen. Ferner sollte festgestellt werden, ob das Fehlen von CLCA1 Auswirkungen auf die Ausbildung von alterstypischen Veränderungen hat und somit das Fehlen des Proteins einen Einfluss auf den Gesundheitszustand der Mäuse im Alter nimmt. Um dies zu erreichen, wurde die alternde Clca1-/--Maus umfassend phänotypisiert. Dafür wurden sowohl klinische Untersuchungen wie die Bestimmung des Körpergewichts sowie hämatologischer und klinischer Parameter als auch eine vollständige pathologische Untersuchung mit Bestimmung der Organgewichte und makroskopischer sowie histopathologischer Untersuchung durchgeführt. Es wurde das Modell einer Querschnittsaltersstudie gewählt, um zu definierten Zeitpunkten eine identische Anzahl von alternden Clca1-/--Mäusen mit deren WT-Geschwistertieren hinsichtlich der Ausbildung von pathophysiologischen Veränderungen vergleichen zu können. In dieser Studie konnte für die alternden Clca1-/--Mäuse kein ausgeprägter, einheitlicher und somit offensichtlicher Phänotyp identifiziert werden, was eine essentielle Funktion des CLCA1-Proteins im Alterungsprozess sehr fraglich erscheinen lässt. Dennoch konnten in Einzelfällen Auffälligkeiten und initiale Beobachtungen für einen möglichen Altersphänotyp aufgezeigt werden. Während sich die Mäuse der beiden Genotypen mit altersgemäßer Physiologie in den klinisch erhobenen Parametern nicht unterschieden, konnten in der pathologischen Untersuchung, wenn auch ohne statistische Signifikanzen, erste initiale Hinweise auf das mögliche Vorliegen eines Altersphänotyps der Clca1-/--Maus im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrolltieren festgestellt werden. Trotz einer höheren Anzahl „systemisch“ erkrankter Tiere im hohen Alter wies die Clca1-/--Maus eine höhere Überlebensrate auf. Ihre Neigung zur Ausbildung inflammatorischer Erkrankungen, wie z.B. der C57BL/6-Dermatitis oder einer Pyometra, schienen hierbei erhöht, wohingegen chronische Entzündungen der Niere und der Zahnalveolen erst zu einem späteren Zeitpunkt auftraten. Hier könnten ähnliche, immunmodulatorische Funktionen es CLCA1-Proteins bei Entzündungen eine Rolle spielen, wie sie bereits mehrfach für verschiedene Mausmodelle publiziert wurden. Ebenso wiesen die hier erhobenen Befunde der Clca1-/--Maus auf ein mögliches erhöhtes Metastasierungsrisiko hämatopoetischer Neoplasien, auf eine mögliche erhöhte Neigung zur Ausbildung endokriner Adenome sowie zu Tumoren des Genitaltraktes hin, was eine bereits hypothetisierte Funktion von CLCA1 als Tumorsuppressor durchaus bestärken könnte. Inwiefern es sich bei den getroffenen Beobachtungen um direkte Auswirkungen des Fehlens des CLCA1-Proteins oder um zufällige Variationen handeln könnte, konnte aufgrund der niedrigen Prävalenz der Befunde sowie der geringen Gruppengrößen nicht abschließend beurteilt werden. Mit dieser Altersstudie konnte ein erster Überblick über einen möglichen Phänotyp in der alternden Clca1-/--Maus aufgezeigt werden. In Einklang mit der bisherigen Literatur wurden eine etwaige immunmodulatorische Funktion sowie die Rolle von CLCA1-Proteinen bei Tumorerkrankungen weiter in den Fokus gerückt. Diese initialen Beobachtungen geben wichtige Anhaltspunkte für weitere Untersuchungen, vor allem hinsichtlich der Fragestellung, warum manche Pathogene oder Stimuli eine vermehrte und andere wiederum eine reduzierte Immunantwort hervorrufen könnten. Ebenso sollten für die Maus, ähnlich wie bereits für einige humane Tumore durchgeführt, Untersuchungen hinsichtlich einer möglicherweise erhöhten Tumoraggressivität und -metastasierungsrate bei Verlust des CLCA1-Proteins angestrebt werden.

The CLCA protein family (chloride channel regulators, calcium-activated) has been in the focus of research by various research groups worldwide for several decades. It consists of complex, highly conserved proteins with a partly broad species-specifically varying expression pattern. In particular, the CLCA1 protein, which is synthesized and entirely secreted by mucus-producing cells, primarily of the respiratory and intestinal tract, exhibits pleiotropic but not yet fully understood functions in humans and mice and has been associated with mucus-related human diseases such as cystic fibrosis, asthma or chronic obstructive pulmonary disease. Recently published studies have hypothesized that CLCA1 may act as mucus processor, immunomodulator or tumor suppressor. Genetically-modified mouse strains are becoming increasingly important as excellent models for human diseases. Clca1-knockout models (Clca1-/-) have been generated and so far used to primarily address questions regarding inflammation. Naive, specified pathogen-free Clca1-/- mice of up to nine months of age lack an observable phenotype. In bacterially or chemicallyinduced inflammation models of the lungs, intestine, and joints, the adult Clca1-/-mouse showed an immunomodulatory phenotype at up to 16 weeks of age. However, elderly mice develop a number of pathophysiological changes during their lifetime, such as the appearance of tumors and inflammatory or degenerative diseases as part of the normal aging process. To date, no knowledge exits concerning the role of the CLCA1 protein in the aging process and the associated development of age-associated pathological changes. Consequently, the aim of this study was to investigate the role of a lack of the CLCA1 protein in the aging process of mice. Furthermore, it was determined whether lack of the CLCA1 protein may have an effect on the development of age-associated alterations and thus whether a lack of the protein has an influence on the health status of mice of advanced age. To this end, the aging Clca1-/- mouse was extensively phenotyped. Clinical parameters such as body weight, comprehensive haematological and clinically chemical investigations of the blood as well as a complete pathological examination including organ weight determination, macroscopy, and histopathology were performed. The model of a cross-sectional aging study was chosen in order to be able to compare an identical number of aging Clca1-/- mice with their WT siblings in regard of the development of patho-physiological changes at defined timepoints. In this study no strong unique and obvious phenotype was observed for the aging Clca1-/- mouse, which makes an essential function of the CLCA1 protein in the aging process very questionable. Nevertheless, first observations on single animals were made for a possible age-related phenotype. While both genotypes of age-related physiology did not differ in the clinically determined parameters, initial pathological evidence for the existence of an aging phenotype of the Clca1-/-mouse compared to the wild-type control animals could be determined, albeit without statistical significance yet. Despite a higher number of "systemically" diseased animals at advanced age, the Clca1-/- mice showed a higher survival rate. Their tendency of developing inflammatory diseases such as C57BL/6 dermatitis or pyometra seemed to be increased, whereas chronic inflammation of the kidney and dental alveoli occurred at a later age. Here, similar immunomodulatory functions of the CLCA1 protein could play a role in inflammation as have already been published for mouse models of several inflammatory conditions. Further findings of this study pointed to a slight possibility of an increased metastasis risk for haematopoietic neoplasia as well as an increased tendency toward development of endocrine adenomas and tumors of the genital tract in the Clca1-/-mouse, which could certainly strengthen a possible function of CLCA1 acting as a tumor suppressor. In this study it could not be conclusively assessed to what extent the observations made could have been direct effects of the absence of the CLCA1 protein or solely random variations due to the low prevalence of findings and small group sizes. Thus, this aging study provided a first overview of a possible phenotype in the aging Clca1-/- mouse. In line with the previous studies, a possibly immunomodulatory function as well as the role of CLCA1 in tumor diseases were suspected. In subsequent studies, these initial observations should be further investigated, especially regarding the underlying causative role of some specific pathogens or stimmuli evoking an increased and others a reduced immune response. Investigations should also be conducted in mice with regard to an increased tumor aggressiveness and metastasis rate in case of loss of the CLCA1 protein, as has already been perfomed for several human tumors.