Entwicklung und Evaluierung eines mikroskaligen, oligonukleotid-gekoppelten Eisenoxidpartikels zur Stimulation kultivierter primärer humaner Hepatozyten

Abstract

Die Leberzelltransplantation ist eine erfolgversprechende Therapie zur Behandlung angeborener Stoffwechseldefekte der Leber sowie des akuten Leberversagens. Im Rahmen der Leberzelltransplantation bieten Partikel- basierte Transfektionssysteme (engl. Particle based delivery systems; PDS), die auf der Inkorporation von Eisenoxidpartikeln in Leberzellen beruhen, perspektivisch die Möglichkeit der Kombination von Diagnostik und Therapie. Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung und Evaluierung eines multifunktionalen oligonukleotid-gekoppelten biokompatiblen mikroskaligen Eisenoxidpartikels (sMPIO-α-LNA) zur Verfolgung transplantierter Leberzellen im MRT und dessen therapeutische Manipulation mittels RNA Interferenz. Der sMPIO bestand aus nanoskaligen Magnetitpartikeln, welche homogen in einer SiO2-basierten Polymermatrix eingebettet waren. Die Oberfläche der Partikel wurde mit Carboxylgruppen konjugiert, was die Anbindung funktioneller Gruppen und therapeutischer Wirkstoffe ermöglichte. In dieser Arbeit wurden antisense Locked Nucleic Acids (α-LNAs) an die Oberfläche des sMPIOs gekoppelt. Die zentrale Funktion des sMPIOs bestand in der Erzeugung eines reproduzierbaren hypointensen MRT-Signals. Hierfür wurden zwei Oberflächenmodifikationen (Poly-L-Lysin, Streptavidin) hinsichtlich ihrer Inkorporationsfähigkeit in Leberzellen getestet. Es konnte eine signifikante Signalauslöschung ab einer Zellzahl von 1.000 primären humanen Hepatozyten bzw. von 5.000 Zellen der Zelllinie Huh-7 in der T2*-gewichteten Sequenz erzielt werden. Für die Verwendung des Partikels als intrazellulären Stimulus der zu transplantierenden Hepatozyten wurde die Let7g-spezifischeα-LNA an den Partikel kovalent gebunden. Die Depletion von über 80% der endogenen microRNA (miRNA) Let7g induzierte 24 Stunden nach Partikelinkubation eine Hochregulation der Zellzyklus-assoziierten Proteine Cyclin D1 und c-Myc. Nachfolgende Proteomanalysen offenbarten weitere Zielproteine, von denen vier als Interaktionspartner der Let7g bekannt sind. Die Transplantation von Partikel-markierten Zellen zeigte nach sieben Tagen eine verstärkte Signalauslöschung im MRT. Das Engraftment der Hepatozyten sowie die Eisenoxidpartikel konnten histologisch nachgewiesen werden. Die Entwicklung des neuartigen Partikels ermöglicht die theragnostische Anwendung in der Leberzelltransplantation. Darüber hinaus ist eine Nutzung des Partikels in der Diagnostik und Therapie von Tumorerkrankungen denkbar.

The liver cell transplantation is a promising therapy for the treatment of inborn metabolic liver disease and acute liver failure. In the course of liver cell transplantation particle based delivery systems (PDS) consisting of iron oxide particles incorporated in liver cells might provide a tool for combination of diagnosis and therapy. The aim of this study was to design a multifunctional oligonucleotide-labeled biocompatible micron-sized iron oxide particle (sMPIO-α-LNA), which combines MRI cell tracking and therapeutic manipulation of primary human hepatocytes by miRNA targeting. The sMPIO consisted of nanometer-scaled magnetite-particles, which were distributed homogenously in a silica-based polymer matrix. The polymeric shell was covered with carboxyl groups allowing the binding of functional groups and therapeutic agents. In this study antisense locked nucleic acids (α-LNA) were covalently bound to the surface of the sMPIO. The main purpose of the sMPIO was to enable a reproducible hypointense MRI signal. Therefore two different surface modifications (Poly-L-Lysin, Streptavidin), which were coupled onto particle surfaces, were tested regarding the incorporation capacity into liver cells. The results showed that 1,000 primary hepatocytes and 5,000 cells of the cell line Huh-7 could be quantified in a T2* weighted imaging. In order to cause an intracellular stimulus of transplanted hepatocytes, a α-LNA specific for the depletion of the microRNA (miRNA) Let7g was covalently bound to the particle surface. The Let7g depletion (80%) resulted in up-regulation of the cell cycle associated target proteins Cyclin-D1 and c-Myc. In further proteome analyses, additional target proteins, which were regulated by sMPIO-α-LNA treatment, were detected. Four of them were identified as interaction partners of Let7g. The transplantation of sMPIO-labeled cells caused an enhanced signal loss in MRI after seven days. The engraftment of the liver cells as well as the iron oxide particles could be visualized by histological staining. The new particle might be used as a theragnostic tool for cell transplantation and additionally for diagnosis and therapy of malignoma.