Functional expression of thermo-sensitive transient receptor potential channels in cultivated human corneal endothelial cells (HCEC-12)

Abstract

The human corneal endothelium (HCE) is indispensable for maintaining corneal transparency and clear vision. There is HCE cell loss during life and after corneal injury or diseases. A limited HCE cell density may cause opacity which can ultimately only be treated by corneal transplantation (keratoplasty). Even after penetrating keratoplasty, HCE cell loss of up to 50 % occurs. During graft storage, about 30 % of the few available corneal grafts have to be discarded due to HCE cell loss. In addition, the durability of corneal grafts depends on the storage temperature. In Western Europe, grafts are stored at ~ 37 °C for periods of up to four weeks, whereas they can only be stored for about two weeks when stored at cold temperatures (~ 5 °C) as preferred in North America. The molecular mechanisms leading to HCE cell loss are still unknown, but a connection to apoptosis is assumed. Therefore, this thesis was undertaken to investigate the functional expression of thermo-sensitive transient receptor potential channels (thermo-TRPs) in HCE cells (HCEC) and their relevance regarding HCE cell loss. Since access to corneal grafts is limited, immortalized HCEC (HCEC-12) were used and primary cultivated HCEC were used additionally. The functional expression of thermo-TRPs was investigated using fluorescence calcium imaging (fura-2/AM) and planar patch- clamp recordings under various physical and pharmacological conditions. Cooling from room temperature (~ 22 °C) to 14 - 18 °C caused an increase of intracellular calcium ([Ca²+]i). In contrast, the cold receptor antagonist BCTC (10 µM) suppressed this cold-induced Ca²+ increase. The super-cooling agent icilin (50 µM) caused an increase of [Ca²+]i and also slightly increased whole-cell outwardly rectifying currents (60 µM icilin). This icilin-induced Ca²+ increase could be suppressed by BCTC (10 µM). Primary cultivated HCEC responded with a similar icilin-induced increase of [Ca²+]i, indicating that normal HCEC also express cold receptors. In contrast, temperature rises over 43 °C as well as the application of capsaicin (20 µM) increased [Ca²+]i by activating heat receptors such as the capsaicin receptor TRPV1. These results demonstrate the functional expression of cold receptors (e.g. menthol receptor TRPM8), as well as heat receptors (e.g. TRPV1) in HCEC-12 cells. It is suggested that these thermo-TRPs are important for the function of HCE and that they might be linked to HCE cell loss. Consequently, thermo-TRPs might present targets for pharmacological modulation to prevent HCE cell loss, which is in the interest of eye banks and patients worldwide.

Das humane Hornhautendothel (HCE) ist für die Transparenz der Cornea und damit für die Sehkraft unentbehrlich. Im Laufe des Lebens, nach Hornhautverletzungen oder -krankheiten kommt es zum Verlust von HCE-Zellen. Eine zu geringe Dichte an HCE-Zellen führt zu einer irreversiblen Trübung der Hornhaut, die letztendlich nur mit einer Hornhauttransplantation (Keratoplastik) behandelt werden kann. Auch nach einer penetrierenden Keratoplastik gehen bis zu 50 % der HCE-Zellen des Transplantats zugrunde. Während der Lagerung der Spenderhornhäute führt der HCE-Zellverlust zum Ausschluss von ca. 30 % des ohnehin knappen Spendergewebes. Die Haltbarkeit der Spenderhornhäute ist außerdem von der Lagerungstemperatur abhängig. In Westeuropa werden sie bei ~ 37 °C gelagert und sind ca. vier Wochen haltbar, bei gekühlter Lagerung (~ 5 °C), wie beispielsweise in Nordamerika bevorzugt, jedoch nur zwei Wochen. Die molekularen Mechanismen, die zum HCE-Zellverlust führen, sind bisher unbekannt. Ziel der Arbeit war es, die funktionelle Expression von temperatursensitiven Transient-Rezeptor-Potential-Kanälen (thermo-TRPs) im HCE zu untersuchen, da diese im Zusammenhang mit dem HCE-Zellverlust über die Regulation von Calcium und Apoptose stehen könnten. Aus Mangel an Spenderhornhäuten wurde die immortalisierte Zellline HCEC-12 für die Experimente verwendet. Eine HCE-Primärzellkultur wurde ebenfalls untersucht und diente als Kontrolle. Die funktionelle Expression der thermo-TRPs wurde mithilfe von Fluoreszenz Calcium Imaging (Fura 2/AM) und planarem Patch- Clamping unter verschiedenen physikalischen und pharmakologischen Bedingungen untersucht. Die Kühlung beginnend bei Raumtemperatur (~ 22 °C) auf 14 - 18 °C führte zu einem Anstieg der intrazellulären Calziumkonzentration ([Ca²+]i). Der Kälterezeptorantagonist BCTC (10 µM) war dagegen in der Lage, den Kälte- induzierten Calciumanstieg zu hemmen. Pharmakologische Kühlung mit dem Kühlwirkstoff Icilin (50 µM) führte ebenfalls zu einem Anstieg der [Ca²+]i sowie zu einem leichten Anstieg von nicht-selektiven auswärts gerichteten Ganzzellströmen (60 µM Icilin). Der Icilin-induzierte Calciumanstieg konnte durch BCTC (10 µM) inhibiert werden. Frisch kultivierte HCE-Primärzellen reagierten mit einem ähnlichen Anstieg des [Ca²+]i nach Icilingabe, was auf die Expression von Kälterezeptoren in normalen HCE-Zellen hindeutet. Temperaturen über 43 °C sowie die Zugabe von Capsaicin (20 µM) erhöhten das [Ca²+]i durch Aktivierung von Hitzerezeptoren wie dem Capasaicinrezeptor TRPV1. Diese Ergebnisse zeigen die funktionelle Expression von Kälterezeptoren (z.B. Mentholrezeptor TRPM8) und Hitzerezeptoren wie TRPV1 in HCEC-12 Zellen. Es liegt nahe, dass diese Kanäle für die Funktion der HCE-Zellen von Bedeutung sind und dass es möglicher Weise einen Zusammenhang zwischen ihnen und dem HCE-Zellverlust gibt. Thermo-TRPs könnten daher einen vielversprechenden Angriffspunkt für eine Pharmakotherapie gegen HCE-Zellverlust darstellen, was für Hornhautbanken und Patienten weltweit von Nutzen wäre.