Funktionelle und molekularbiologische Untersuchungen zum Glukosetransport am proximalen Jejunum des Schweins

Abstract

Schweine decken ihren Energiebedarf über kohlenhydratreiche Mahlzeiten. Dies erfordert hocheffiziente Mechanismen der Glukoseresorption im Dünndarm. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Glukoseaufnahme in das proximale Jejunum des Schweins bei höheren luminalen Konzentrationen (6 bis 20 mM) funktionell zu charakterisieren und ein systematisches Screening auf Glukosetransporter- mRNA im porzinen Jejunum sowie in weiteren für die Glukose-Homöostase wichtigen Organen durchzuführen. Für die Glukoseaufnahmestudien wurde der apikale Uptake von radioaktiv markierter Glukose in das Dünndarmepithel gemessen. Zusätzlich wurden der Kurzschlussstrom und die Leitfähigkeit mit Hilfe der Ussing-Kammer-Technik erfasst. Mögliche Wechselwirkungen der Glukoseresorption mit anderen zellulären Stoffwechselwegen (Glykolyse und Glukoneogenese) und eine mögliche Glukoseresorption über Endozytose wurden überprüft. Durch vergleichende Analysen der Aufnahme bzw. des Fluxes von radioaktiv markiertem Mannit wurde auch die Möglichkeit einer parazellulären Resorption überprüft. Außerdem wurde mittels Zweischritt-RT-PCR die mRNA verschiedener Glukosetransportproteine im proximalen Jejunum Leber, Niere und Skelettmuskulatur nachgewiesen. Bei einer Konzentration von 10 mM Glukose hemmten sowohl der kompetitive SGLT1-Hemmstoff Phlorizin (0,1 mM) als auch die GLUT-Hemmstoffe Phloretin (0,2 mM) und Cytochalasin B (0,2 mM) die Glukoseaufnahme in das Epithel. Nach 10- oder 20 minütiger Vorinkubation mit 10 mM Glukose konnte allerdings keiner der Hemmstoffe eine signifikante Hemmung der Glukoseaufnahme erzielen. Mit Hilfe des nach Glukosezugabe (10 mM) stattfindenden Kurzschlussstrom-Anstieges ließ sich eine Transportrate des SGLT1 von etwa 7,5 nmol Glukose pro cm2 und min errechnen. Die Hemmwirkung des Phlorizins auf die Glukoseaufnahme überstieg diesen Wert jedoch um ein Vielfaches. Chlorpromazin (20 µM), ein Hemmstoff der Clathrin-vermittelten Endozytose, führte zu einem Verschwinden der Phlorizin- und Phloretin- hemmbaren Glukoseaufnahme, während ein Kurzschlussstrom-Anstieg nach Glukosezugabe noch vorhanden war. Sowohl serosal appliziertes Phloretin (0,2 mM) als auch beidseitig angewendetes N-Acetyl-D-Glukosamin (20 mM), ein Hemmstoff der Hexokinase, führten bei einer Konzentration von 20 mM Glukose zu einer verminderten Glukoseaufnahme in das Epithel. Nach Verhinderung einer intrazellulären Laktatanreicherung durch Verwendung laktatfreier Pufferlösung und gleichzeitiger Hemmung der Laktatdehydrogenase mit Na-Oxamat (20 mM), war auch nach mehr als dreistündiger Vorinkubation mit Glukose (6 mM) eine Hemmwirkung von Phlorizin (0,1 mM) auf die Glukoseaufnahme nachweisbar, während mukosal appliziertes Phloretin (0,2 mM) keinen Effekt hatte. Bei Verhinderung der Glukosebildung aus Laktat durch Hemmung des Glukoneogenese- Schlüsselenzyms PEPCK mit 3-Mercaptopicolinsäure (0,2 mM) war ebenfalls nach mehr als dreistündiger Vorinkubation ein Effekt von Phlorizin (0,1 mM) jedoch nicht von Phloretin (0,2 mM) auf die Glukoseaufnahme (6 mM) nachweisbar. Über einen Zeitraum von 20 min erfolgten in Anwesenheit von Phlorizin (0,5 mM) und Phloretin (0,5 mM) die Glukose- und Mannitaufnahmen bei gleicher Konzentration (20 mM) in einem Verhältnis von etwa 1:0,65 zueinander, während deren Fluxe annähernd im Verhältnis 1:1 standen. Die Fluxe (jedoch nicht die Aufnahmen) von Glukose und Mannit korrelierten mit der Gewebeleitfähigkeit. Im Jejunum konnte die mRNA von SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT5, GLUT7 und GLUT8 nachgewiesen werden; GLUT3, 4, 10 und 11 waren schwach detektierbar. Die Leber enthielt die mRNA von SGLT1, GLUT1, GLUT2 und GLUT8; GLUT3, 4, 5, 10 und 11 waren schwach detektierbar. Die Niere war positiv für SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT5, GLUT8 und GLUT11; GLUT3, 4 und 10 waren schwach detektierbar. Die Skelettmuskulatur war positiv für den GLUT4; GLUT1, 3, 5, 8, 10 und 11 zeigten schwache Signale. Drei neue Gensequenzen porziner GLUT wurden identifiziert. Der SGLT1 und ein apikaler GLUT, wahrscheinlich der GLUT2 (Kellett-Hypothese), sind an der Glukoseaufnahme in das porzine Dünndarmepithel beteiligt. Der apikale GLUT wird durch den SGLT1 induziert und Clathrin-abhängig eingebaut. Er ermöglicht in den ersten Minuten nach Glukosezugabe eine Anreicherung von Glukose in der Zelle und wird danach inaktiv. Wird die Anreicherung von Glukose im Enterozyten durch intrazelluläre Glukoneogenese und verminderten basolateralen Efflux forciert, sinkt die apikale Glukoseaufnahme. Eine endozytotische Aufnahme von Glukose (oder Mannit) konnte nicht nachgewiesen werden. Es gibt jedoch Hinweise auf eine geringe parazelluläre Resorption und auf einen weiteren Aufnahmemechanismus für Glukose und Mannit. In den für die Glukosehomöostase wichtigen Organen Darm, Leber, Niere und Skelettmuskulatur werden mRNA für verschiedene Transportproteine mit einer gewissen Redundanz exprimiert.

Pigs cover their energy demand with meals rich in starch and carbohydrates. That requires highly efficient mechanism of glucose absorption in the small intestine. The aim of the present studies was to characterize glucose uptake at higher luminal concentrations (6-20 mM) in proximal jejunum of pig and to undertake a systematic screening for the presence of mRNA of glucose transport proteins in main organs of glucose absorption, production and conservation. In the glucose uptake studies, apical uptake of radioactively labeled glucose into the epithelial layer of the porcine small intestine was measured. Furthermore, transepithelial short-circuit current and transepithelial conductance were measured by using the Ussing chamber technique. Possible interactions between glucose absorption and other metabolic activities like glycolysis or gluconeogenesis were investigated, as well as the possible involvement of endocytosis in glucose absorption. With comparative studies on uptake und flux of radioactively labeled mannitol, the involvement of paracellular permeation was examined. Finally, the presence of mRNA of glucose transport proteins in main organs of glucose homeostasis like proximal jejunum, liver, kidney and skeletal muscle were investigated via two-step RT- PCR. The competitive SGLT1 inhibitor phlorizin (0.1 mM), as well as GLUT inhibitors phloretin (0.2 mM) and cytochalasin B (0.2 mM), caused significant inhibition of glucose absorption into the epithelium (at 10 mM glucose concentration). 10 or 20 minutes after pre-incubation with glucose (10 mM), none of these inhibitors achieved a significant inhibition of glucose absorption. The increase of short-circuit current after mucosal glucose addition (10 mM) allowed to calculate the transport capacity of SGLT1 (approx. 7.5 nmol•cm-2•min-1). The inhibiting effect of phlorizin on glucose uptake was multiple times greater. Chlorpromazin (20 µM), an inhibitor of clathrin- mediated endocytosis, caused disappearance of phlorizin and phloretin inhibited glucose uptake, while the increase of short-circuit current after glucose addition was still evident. Serosally administered phloretin (0.2 mM), as well as bilaterally administered N-acetyl-D-glucosamine (20 mM), a hexokinase inhibitor, led at high glucose concentrations (20 mM) to reduced glucose uptake into the epithelium. After more than 3 hours pre-incubation time with glucose (6 mM) and prevention of intracellular lactate accumulation by using a lactate-free buffer and simultaneos inhibition of lactate dehydrogenase by Na-oxamate (20 mM), phlorizin (0.1 mM) still inhibitied glucose uptake, but phloretin (0.2 mM) did not. After more than 3 hours pre- incubation time with glucose (6 mM), avoiding gluconeogenesis from lactate by inhibition of the gluconeogenesis key-enzyme PEPCK via 3-mercaptopicolinic acid (0.2 mM), phlorizin (0.1 mM) but not phloretin (0.2 mM) inhibited glucose uptake, too. Over a period of 20 minutes and in presence of phlorizin (0.5 mM) and phloretin (0.5 mM) glucose and mannitol were taken up into the epithelium at the ratio of 1:0.65 at identical concentrations (20 mM), while the fluxes showed a ratio of 1:1. Fluxes of glucose and mannitol, but not uptakes correlated with transepithelial conductance. The jejunum contained mRNA for SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT5, GLUT7 and GLUT8, while GLUT3, 4, 10 und 11 were also detectable. The liver contained SGLT1, GLUT1, GLUT2 und GLUT8 mRNA, while GLUT3, 4, 5, 10 and 11 were poorly detectable. The kidney was positive for mRNA of SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT5, GLUT8 and GLUT11, but traces of GLUT3, 4 and 10 mRNA could also be detected. Skeletal muscle had the strongest signal for GLUT4 mRNA, while GLUT1, 3, 5, 8, 10 and 11 showed weak signals. Altogether, new porcine gene sequences of 3 glucose transport proteins were identified. The SGLT1 and an apical GLUT, probably GLUT2 (Kellett hypothesis) are involved in glucose uptake in porcine jejunal epithelium. SGLT1 induces the apical GLUT. Furthermore intact assembly of clathrin-coated vesicles seems to be necessary for apical insertion of GLUT2. GLUT2 facilitates intracellular glucose accumulation a few minutes after glucose addition and then becomes inactive. Intracellular glucose accumulation by gluconeogenesis or reduced basolateral glucose exit decreases apical glucose uptake. Endocytotic apical glucose and mannitol uptake was not approved and parazellular absorption played a minor role. There are hints for an additional transport mechanism, which is able to transport mannitol in addition to glucose. In main organs of glucose homeostasis like proximal jejunum, liver, kidney and skeletal muscle, mRNA of different glucose transport proteins are expressed with redundancy.