Molecular and Proteomic Species Characterisation of Cyathostomins

Abstract

Cyathostomins are currently considered to be the most important equine parasites, due to their ubiquitous prevalence, their ability to cause potentially fatal larval cyathostominosis and their widespread and progressing anthelmintic resistance. Multi-species infections, comprising usually more than 15 species simultaneously, impede research on the contributions of individual species to the pathogenesis as well as development of anthelmintic resistance in individual species. Research in cyathostomins e.g. on multi-species composition and species-specific pathogenicity is currently hampered by insufficient diagnostic tools. Particularly universally applicable methods, that are non-invasive and life-stage independent are needed. Molecular methods appear useful but can be resource and time-consuming, and some are limited to specific species, only. Proteomics methods, such as matrix-assisted laser desorption/ionisation-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) allow species identification on the basis of matching protein patterns of organisms. In this thesis a detailed evaluation of the application of MALDI-TOF MS on cyathostomins is given. A protocol based on protein extraction with equal volumes of acetonitrile and formic acid, followed by ultrasonic homogenisation and DNA isolation after buffering with Tris-buffer was established and successfully applied. It was demonstrated that this protocol was applicable to repeatably obtain high-quality mass spectra from cyathostomins that were freshly collected during necropsy and immediately fixed in 70 % ethanol. The mass spectra of two closely related species, namely Cylicostephanus longibursatus and Cylicostephanus calicatus, were examined with a bioinformatics workflow using freely available software. Despite their close relationship, all examined specimen of both species were reliably differentiated from each other. Mass peaks were sorted according their influence on discrimination. Although a rate of identification of close to 100 % was reached, it should be noted that no single peak alone occurred only in one of the two species as it would be required to be used as biomarker for species identification. Of importance for this work is the fact that this protocol allows to retrieve protein extracts of whole worms and to perform subsequent DNA extraction for PCR. As a result, the worms that were identified morphologically, could be used for protein profiling and molecular characterisation. Two different markers, the internal transcribed spacer (ITS) 2 and cytochrome oxidase I (COI) were applied and revealed three clusters within Cylicostephanus minutus. Since two of the clusters were already described as potential cryptic species of Cys. minutus and designated as operational taxonomic units (OTU) I and II, the third was designated OTU III. A total of 22 individual worms of this species were examined and one, nine and twelve specimens could be assigned to OTU I, II, and III, respectively. For each marker and species/OTU, the sequences were compaired pairwise. The identities within the same species/OTUs were higher than between the OTUs. Identities between species and OTUs were lower for COI locus than for ITS-2 locus, indicating higher inter-species variability for COI. No identitification of the different OTUs in the proteomic analysis was possible, which could be linked to the low number of specimen available of each OTU. However, MALDI-TOF MS represents a step towards a universally applicable method for species identification of cyathostomins, provided the technical infrastructure as well as a comprehensive master spectra library is available. To set up a proteomic master spectra library, the individual species should be examined in parallel molecularly to detect cryptic species. A close examination of two additional species, Coronocyclus coronatus and Cylicostephanus calicatus has been performed in this study. Although both species are placed in different genera based on morphological descriptions, sequence identities on the ITS-2 locus were up to 100 %. This stresses the need for the employment of the COI marker that allowed, together with the ITS-2 marker, delineation of both species. Furthermore, different nuclear and mitochondrial haplotypes were identified for each species. For Cyc. calicatus, two different genospecies were identified based on two ITS-2 variants, which are associated with distinct mitochondrial haplotypes and point towards a cryptic species complex of at least two non-interbreeding species. In short, it should be summarised, that the current methods for species identification of cyathostomins are not sufficient and that the species complexity of cyathostomins is even more complicated than anticipated. To establish MALDI-TOF MS as a new method for species identification, molecular research should be performed to correctly delineate cyathostomin species that can be subsequently used for establishing a master spectra library for protein profiling.

Aufgrund ihres ubiquitären Vorkommens, ihrer Fähigkeit die potenziell tödliche larvale Cyathostominose zu verursachen und wegen der weit verbreiteten und fortschreitenden Anthelmintikaresistenz, werden Cyathostomine derzeit als die wichtigsten Pferdeparasiten angesehen. Multispeziesinfektionen, die üblicherweise mehr als 15 Spezies umfassen, erschweren die Erforschung der Beteiligung der einzelnen Spezies an der Krankheitsentwicklung, so wie auch an der Entwicklung von Anthelmintikaresistenz in einzelnen Spezies. Die Erforschung von Cyathostominen, beispielsweise hinsichtlich der Zusammensetzung der vorherrschenden Multispezieskomplexe aber auch der speziesspezifischen Pathogenität ist derzeit durch unzureichende diagnostische Methoden eingeschränkt. Insbesondere werden universell anwendbare Methoden, die nicht-invasiv und unabhänging vom Lebenszyklus des Parsiten sind, benötigt. Molekulare Methoden erscheinen hilfreich, können jedoch material- und zeitaufwendig sein und sind bisher auf bestimmte Spezies beschränkt. Proteomische Methoden, wie die Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations – Flugzeit Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) ermöglichen die Identifikation einzelner Spezies anhand des Abgleiches von Proteinmustern von Organismen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde MALDI-TOF MS zur Anwendung bei Cyathostominen evaluiert. Es wurde ein Protokoll, basierend auf Proteinextraktion mittels gleicher Volumina von Acetonitril und Ameisensäure, gefolgt von Ultraschallhomogenisierung und DNA Isolation nach Pufferung mit Trispuffer etabliert und erfolgreich angewandt. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Protokoll anwendbar ist, um wiederholbar qualitativ hochwertige Massenspektren von Cyathostominen, welche während Sektionen frisch gesammelt und in 70 %igen Ethanol fixiert wurden, zu erhalten. Die Massenspektren zweier nah verwandter Spezies, Cylicostephanus longibursatus und Cylicostephanus calicatus, wurden mittels frei erhältlicher Software untersucht. Trotz ihrer nahen Verwandtschaftbeziehung konnten alle untersuchten Exemplare verlässlich voneinander unterschieden werden. Die ermittelten Massenhöchstwerte wurden anhand ihres Einflusses zur Unterscheidung sortiert. Obwohl eine Identifikationsrate von annhähernd 100 % erreicht wurde, sollte beachtet werden, dass kein Massenhöchstwert ausschließlich in einer Spezies vorkommt und deshalb kein einzelner Marker zu Speziesidentifizierung herangezogen werden kann. Von besonderer Bedeutung für diese Arbeit ist, dass dieses Protokoll sowohl die Gewinnung von Proteinextrakten vollständiger Würmer, als auch von DNA für nachfolgende PCR-basierte Analysen ermöglicht. Dadurch konnten morphologisch identifizierte Würmer sowohl zur Erstellung von Proteinprofilen, als auch zur molekularen Charakterisierung herangezogen werden. Zwei unterschiedliche Marker, der interne transkribierte Platzhalter 2 (ITS-2) und die erste Cytochromoxidase-Untereinheit (COI) wurden verwendet, und damit drei taxonomische Gruppierungen innerhalb der Art Cylicostephanus minutus identifiziert. Da zwei Gruppierungen bereits als Operationale taxonomische Einheiten (OTU) I und II beschrieben wurden, wurde die Dritte als OTU III bezeichnet. Insgesamt wurden von dieser Spezies 22 Individuen untersucht, von denen ein Exemplar OTU I, neun Exemplare zu OTU II und zwölf Ememplare zu OTU III zugeordnet werden konnten. Jeder dieser Marker wurde paarweise miteinander verglichen. Die Ähnlichkeit innerhalb der gleichen Spezies/OTU waren größer als zwischen den verschiedenen OTUs. Die Ähnlichkeit zwischen Spezies und OTUs waren für den COI Lokus geringer als für den ITS-2 Lokus, was auf eine höhere Variabilität der Spezies am COI Lokus hinweist. Die Identifikation der OTUs bzw. die entsprechende Differenzierung der untersuchten Würmer mittels proteomischer Analyse war nicht möglich, was auf die geringe Anzahl an Exemplaren für jedes OTU zurück zu führen sein könnte. Nichtsdestoweniger stellt das hier etablierte MALDI-TOF MS-basierte Protokoll einen ersten wesentlichen Schritt in die Richtung einer universell anwendbaren Methode zur Speziesdifferenzierung von Cyathostominen dar. Ein wichtiger nächster Schritt ist die Etablierung einer umfassenden Referenzspektrensammlung. Um eine proteomische Referenspektrendatenbank zu erstellen, sollten die individuellen Spezies parallel molekular untersucht werden um eventuelle kryptische Spezies zu festzustellen. Zwei weitere Spezies, Coronocyclus coronatus and Cylicostephanus calicatus wurden im Rahmen dieser Dissertation eingehend untersucht: Obwohl beide Spezies anhand von morphologischen Beschreibungen in verschiedene Gattungen eingeordnet werden, stimmten die Nukleotidsequenzen am ITS-2 Lokus bis 100 % überein. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit der Anwendung des COI Markers, der zusammen mit dem ITS-2 Marker eine Unterscheidung beider Spezies ermöglichte. Des Weiteren wurden für beide Spezies unterschiedliche nukleare und ribosomale Haplotypen identifiziert. Bei Cyc. calicatus konnten zwei ITS-2 Varianten, die mit unterscheidlichen mitochondrialen Haplotypen einhergehen, bestimmt werden und deuten auf einen nicht hybridisierenden Komplex kryptischer Spezies hin. In Kürze ist zusammenzufassen, dass die derzeitigen Methoden zur Speziesbestimmung von Cyathostominen nicht ausreichen und, dass die Komplexität der Cyathostominspezies wesentlich ausgeprägter ist, als bisher angenommen wurde. Um MALDI-TOF MS als neue Identifierungsmethode zu etablieren, ist es notwendig die Spezies molekular abzugrenzen und nachfolgend zur Erstellung von Referenzspektren heranzuziehen.