Verbesserte Methoden zur Erfassung mikrofluorimetrischer Signale am Beispiel der Autofluoreszenz von FAD und NAD(P)H zur Analyse des Energiebedarfs hippokampaler neuronaler Funktionen

Abstract

Abstrakt Die „Light Emitting Diode“ (LED) als Beleuchtungseinheit in der Mikroskopie hat in den letzten Jahren einen festen Platz eingenommen. Dies betrifft nicht nur die Durchlichtmikroskopie sondern auch weite Bereiche in der Fluoreszenzmessung und Optogenetik. Ihre Vorteile liegen u.a. in der Lebensdauer, stufenlosen Regulierbarkeit der Intensität und einer periodischen Ansteuerbarkeit im μs Bereich. Gleichzeitig gab es auf dem Gebiet der Fotodetektion mit dem Einzug der „Avalanche Photodiode“ (APD) und weiterentwickelten Hybriddetektoren eine Verbesserung in der Quanteneffizienz (QE) im Vergleich zum „Photomultiplier Tube“ (PMT). Begründet aus dieser Entwicklung ergab sich die Frage, ob eine Verbesserung in Bezug auf Fototobleichen in biologischen Experimenten bei einer kombinierten Anwendung von LED und APD erreicht werden kann. Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Entwicklung und Erprobung von optischen, elektronischen und mechanischen Komponenten an einem Mikroskopsystem. Mit den neuen Aufbauten wurde eine Reihe von biologischen Experimenten durchgeführt. So konnten die intrinsischen Fluoreszenzen von Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat und Flavin- Adenine-Dinucleotid (NAD(P)H und FAD) parallel untersucht und kombiniert werden mit einem Vergleich von Fotodetektoren bezüglich Sensitivität und Signal-Rausch Verhältnis in Human Embryonic Kidney (HEK) 293 Zellen und akuten Hirnschnitten der Ratte. Zu Beginn wurde die Erholung nach dem Bleichen von NAD(P)H in HEK293 Zellen in Abhängigkeit des Substrates (Glukose, 2-deoxy-D-Glukose, Laktat) aufgezeichnet. Um die Beteiligung astrozytärer Laktatzufuhr im Energiemetabolismus der Nervenzellen zu testen, haben wir Stimulus induzierte Veränderungen der NAD(P)H/FAD Fluoreszenz in hippokampalen Gehirnschnitten mit und ohne Blockade der Laktattransporter aufgezeichnet. Wir konnten zeigen, dass eine mit Pulsen angesteuerte LED im Vergleich zur kontinuierlichen Beleuchtung mit einer LED zu weniger Fotobleichen ohne Verluste an Fluoreszenzintensität bei der Aufzeichnung von FAD führte. Die empirisch ermittelten Parameter an Belichtungszeit und Frequenz sind 5 Hz und 5 ms. Bei allen Experimenten konnte die Überlegenheit der LED gegenüber Quecksilberdampflampen aufgezeigt und genutzt werden. Insbesondere bei der parallelen Aufzeichnung von NAD(P)H und FAD bei Untersuchungen zum Zellmetabolismus kamen die Vorteile der LED zum Tragen.

Abstract In recent years Light Emitting Diodes (LEDs) became a preferred component for use in microscopy applications. Not only as light sources for transmitted light microscopy but also as excitation light sources for fluorescent microscopy and optogenetics. The advantages of LEDs are the enhanced life-span, the stepless intensity regulation and their switching capability in the μs range. At the same time, semiconductor-based photodetectors gained a foothold by the introduction of avalanche photodiodes (APDs) and different forms of ´hybrid´ detectors with improved quantum efficiency (QE) as compared to conventional photomultiplier tubes (PMTs). Due to these developments it was plausible to ask whether a replacement of the fluorescent light source and detector by an LED and APD combination would decrease the photo-bleaching in experiments with sensitive biological preparations. The central aim of the study was the design and technological development of the optical, electrical and mechanical components for such a replacement on a commercially available microscope system. By using the novel system we made parallel recordings of the intrinsic fluorescence of Nicotinicacid-Adenine-Dinucleotide-Phosphate und Flavin-Adenine-Dinucleotide (NAD(P)H and FAD), in combination with the comparison of different photo- detectors with respect to their sensitivity and signal-to-noise ratio in Human Embryonic Kidney (HEK) 293 cells and in rat brain slices. First, we monitored photo-bleaching and metabolism dependent recovery of NAD(P)H fluorescence in HEK293 cells in dependence of available substrates (glucose, 2-deoxy-glucose and lactate). In order to identify the contribution of astrocytic-neuronal lactate shuttle to energy metabolism, we measured stimulus induced changes in NAD(P)H / FAD fluorescence in hippocampal slices in the presence and absence of lactate transport inhibitors. We have shown that a pulsed LED illumination protocol achieved reduced photobleaching with the same fluorescence yield of FAD as compared to continuous illumination. The empirical optimum of the illumination parameters with our system were 5 Hz and 5 ms with respect to pulse duration and frequency. In all of these experiments LEDs demonstrated a clear benefit in comparison with conventional Mercury arc lamps. LED excitation was of particular advantage for parallel recordings of NAD(P)H and FAD fluorescence in studies of energy metabolism.