A novel role of CDK5 in tumor growth, migration and proliferation of breast cancer cell lines MDA-MB-231 and BT-474

Abstract

Although the overall survival and relapse-free survival of breast cancer patients has increased in the past few decades due to novel treatment methods, the therapeutic options especially for the triple-negative and HER2-positive subtypes are limited. Multiple studies identified an important role of cyclin-dependent kinases in different cancer types. In this study we investigated the pro-cancer effect of cyclin-dependent kinase 5 (CDK5) to understand its possible role in the tumor growth, migration and proliferation of breast cancer cell lines. The overall survival (n = 1402) and the relapse free survival (n = 3951) of patients with breast cancer depending on the expression of CDK5 was analyzed using the software KM plotter. To evaluate the CDK5 expression of tumor tissue compared to non tumor tissue, The Cancer Genome Atlas (TCGA) data set of breast cancer patients (n = 536) was investigated. Additionally, western blotting was used to identify the expression levels of CDK5 in different breast cancer cell lines in vitro. We then focused on the CDK5 overexpressing cell lines MDA MB-231 and BT-474 to investigate the role of CDK5 in tumor growth, proliferation and migration. For this, we used soft agar, sulforhodamine B and wound healing assays. These assays were performed in three different setups (group 1: CDK5 overexpression with plasmid; group 2: CDK5 silencing with siRNA; group 3: unspecific inhibition of several CDKs using Roscovitine). Through western blotting, connections between CDK5 and the oncogenic signaling mTOR pathway as well as integrin β4 were investigated. High expression of CDK5 correlates with a poorer overall survival and relapse-free survival rate of breast cancer patients. The analysis of the TCGA data set also reveals higher levels of CDK5 in breast cancer tissues compared to non-tumor tissues. The western blotting indicates an overexpression of CDK5 in breast cancer lines MDA-MB-231, BT-474 and ZR-75. The assays show that CDK5 overexpression leads to increased tumor growth, cell proliferation and migration in vitro. Specific and unspecific CDK5 inhibition show opposite effects compared to CDK5 overexpression. Additionally, we observed that CDK5 activates the mTOR pathway and upregulates integrin β4. In summary, the results show a new role of CDK5 and its clinical relevance in breast cancer progression. Additionally, integrin β4 also seems to play an important role in breast cancer mediated by CDK5. This makes CDK5 a potentially new target in the treatment of breast cancer, especially for triple-negative and HER2 positive breast cancer subtypes.

Obwohl sich das Gesamtüberleben und das rezidivfreie Überleben von Patienten mit Brustkrebs in den letzten Jahrzehnten verbessert haben, sind die therapeutischen Optionen, insbesondere für den tripelnegativen und HER2-positiven Brustkrebs, limitiert. Vorausgehende Studien belegen die wichtige Rolle der zyklinabhängigen Kinasen für die Entstehung von multiplen Karzinomen. In dieser Studie wurde der karzinogene Effekt von der zyklinabhängigen Kinase 5 (CDK5) untersucht, um ihre Bedeutung für das Tumorwachstum, die Proliferation und die Migration von malignen Brustkrebszellen zu verstehen. Methoden Das Gesamtüberleben (n = 1402) und das rezidivfreie Überleben (n = 3951) von Patientinnen mit Brustkrebs wurde in Abhängigkeit von der CDK5-Expression unter Verwendung der Software KM plotter analysiert. Mithilfe der The-Genome-Cancer-Atlas-Daten von Patientinnen mit Brustkrebs (n = 536) wurde die Expression von CDK5 im Tumorgewebe im Vergleich zu gesundem Gewebe untersucht. Die Expressionslevel von CDK5 wurden in multiplen Brustkrebszelllinien in vitro mithilfe von Western Blots detektiert. Wir führten die nachfolgenden Untersuchungen anhand der CDK5-überexprimierenden Zellen MDA-MB-231 und BT-474 durch. Hierfür erfolgten Soft-Agar-, Sulforhodamine-B- und Wundheilungsassays, um die Bedeutung der CDK5 für das Tumorwachstum, die Proliferation und Migration zu bestimmen. Die Experimente wurden jeweils in drei Behandlungsgruppen durchgeführt (Gruppe 1: CDK5- Überexpression mittels Plasmid DNA, Gruppe 2: spezifische CDK5-Inhibition mittels siRNA, Gruppe 3: unspezifische Inhibition von CDKs mittels Roscovitin). Mittels Western Blot erfolgte zudem die Untersuchung der Beziehung zwischen CDK5 und dem bekannten karzinogenen mTOR-Signalweg sowie Integrin b4. Ergebnisse Eine erhöhte Expression von CDK5 in Patientinnen mit Brustkrebs korreliert signifikant mit einem kürzeren Gesamtüberleben und rezidivfreien Überleben. Die Analyse der TCGA-Daten deckte höhere Level von CDK5 in Brustkrebsgewebe im Vergleich zu gesundem Gewebe auf. Die Ergebnisse der Western blots weisen auf eine Überexprimierung in den Brustkrebszelllinien MDA-MB-231, BT-474 und ZR-75 hin. Es zeigt sich zudem, dass die Überexpression von CDK5 das Tumorwachstum, die Proliferation und Migration von malignen Brustzellen in vitro signifikant erhöht. Die spezifische und unspezifische Inhibition von CDK5 führt hingegen zu einer Reduktion des Tumorwachstums, der Proliferation und der Migration im Vergleich zur CDK5- Überexpression. Zusätzlich wurde gezeigt, dass CDK5 den mTOR-Signalweg aktiviert und Integrin b4 heraufreguliert. Fazit Zusammengefasst legen unsere Ergebnisse eine neue Bedeutung der CDK5 und ihrer klinischen Relevanz in der Progression von Brustkrebs dar. Zusätzlich scheint Integrin b4 eine karzinogene Rolle im Brustkrebs zu spielen und wird möglicherweise von CDK5 reguliert. Dies macht CDK5 zu einem potentiellen neuen Zielprotein, insbesondere im triplenegativen und HER2-positiven Brustkrebs.