Expressionsanalyse des Killer-Inhibitory-Rezeptors CD158b auf CD8 T-Lymphozyten, die spezifisch für Humanes Cytomegalievirus sind

Abstract

HCMV-spezifische CD8 Memory T-Lymphozyten spielen bei der Kontrolle der Virusreplikation und dem Schutz gegenüber HCMV-bedingten Erkrankungen eine wichtige Rolle. Mit der direkten Bestimmung antigenspezifischer CD8 Memory T-Lymphozyten mittels peptidspezifischer Kurzzeitstimulation und anschließender flowcytometrischer intrazellulärer Cytokinbestimmung (IFN-γ) und der direkten Untersuchung virusspezifischer T-Zellen mittels Färbung mit HCMV-Peptid-MHC-Tetramer-Komplexen ergibt sich Möglichkeit der Phänotypisierung unterschiedlicher Subsets, sowie die Nachweis wichtiger Epitope in der Immunantwort gegen HCMV. In dieser Arbeit wurde die Expression des Killer-Inhibitory-Rezeptors CD158b auf spezifischen CD8 T-Lymphozyten gesunder Probanden mit diesen Methoden untersucht. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine größerer Teil der CD158b positiven CD8 T-Lymphozyten auf unspezifische mitogen-vermittelte Signale (PMA und OKT3) mehr IFN-γ produziert als unter den CD158b negativen CD8 T-Lymphozyten. Gleichzeitig aber zeigte nur ein kleinerer Teil bzw. nur einige wenige der CD158b positiven CD8 T-Lymphozyten eine Reaktion auf TCR-spezifische Stimuli, die eine oligoklonale Aktivierung bewirken durch Bevorzugung bestimmter Vβ-Familien (Stimulation mit SEB) oder aber auch klonale Aktivierung durch Viruspeptide. Der direkte Nachweis spezifischer Antigenerkennung durch Tetramer-Komplexe beladen mit Viruspeptiden ergab ebenfalls ein geringeres Auftreten von HCMV-spezifischen CD8 T-Lymphozyten in der CD158b positiven Subpopulation. Die Untersuchung Vβ- Familien in der CD158b positiven Subpopulation zeigte eine oligoklonale Expansion bestimmter Vβ-Familien. Diese waren aber nicht identischmit denen, die bei gegebenem HLA-Kontext bei der Infektion mit HCMV auftreten. Ebenso wenig konnten HCMV-klonspezifische TCR-Transkripte in CD158b positiven CD8 T-Lymphozyten nachgewiesen werden. Die Beobachtung wurde, unter Beachtung methodischer Gesichtspunkte, als Merkmal im Verlauf der Generierung von Memory-T-Zellen diskutiert. Es lässt sich aus dieser Arbeit schlussfolgern, dass die Expression von CD158b nicht einfach ein Ausdruck der Antigenerfahrenheit von T-Zellen ist. Möglicherweise sind KIR in bestimmten Stadien der Entwicklung von Memory-T-Zellen gering exprimiert. Andererseits ist es wahrscheinlich, dass HCMV nicht das Antigen ist, welches bei gesunden Probanden zu einer KIR-Expression führt. Es wäre möglich, dass KIR negative HCMV-spezifische CD8 T-Lymphozyten nur bei Gesunden vorhanden sein, wohingegen bei Patienten mit einer HCMV-Erkrankung spezifische Zellen KIR exprimieren. Die konkrete Funktion des Moleküls auf der Oberfläche von CD8 T-Lymphozyten in vivo ist weiterhin unklar. Zur Aufklärung der funktionellen Aspekte in vivo sind weitere Untersuchungen nötig. Dabei wäre insbesondre interessant die Expression der NKR im Verlauf von HCMV-Infektionen und HCMV-Erkrankungen z.B. bei immunsupprimierten Patienten zu untersuchen. Hierbei könnten sich große Unterschiede zu den Ergebnissen bei gesunden Probanden ergeben und möglicherweise wesentlich mehr spezifische T-Lymphozyten auch NKR exprimieren. Untersuchungen der intrazellulären Signalkette der Aktivierung in T-Lymphozyten könnten Aufschluss über das Zusammenwirken von inhibitorischen und aktivierenden Signalen, abhängig vom jeweils vorhandenen Stimulus, geben.

HCMV-specific CD8 T-lymphocytes play an important role in control of viral replication and preventing HCMV disease. Direct assessment of virus specific cells by peptide specific short-time stimulation assay and subsequent measurement of intracellular cytokine production as well as direct visualization by HCMV-peptide-MHC-tetrameric complexes allow phenotypic characterization of different T-cell subsets. Expression of CD158b on human CD8 T-cells is associated with terminal effector differentiation typically reflected by expression of CD57, CD45RO and down-regulation or lack of CD27, CD28, L-Selectin, and CCR7. It has been proposed that Killer Inhibitory Receptor positive T-cells occur in response to chronic antigen-driven stimulation by reactivated endogenous pathogens, including different herpes viruses, such as HCMV, EBV as well as certain tumor antigens. If this were the case, one might expect that chronically stimulated HCMV specific CD8 T-cells should express KIR. This work addresses the distribution of HCMV specific CD8 T-cells in the CD158b-positive and -negative subsets using multi-color flow- cytometry, cell sorting and a semi-quantitative clonotype PCR. It shows that for the most part HCMV specific CD8 T-cells are not contained in the CD158b positive subset. In addition it was demonstrated that these cells produce clearly more IFN-g upon stimulation with Ionomycin and OKT3 compared to the negative subset, but the contrary is true after stimulation with SEB. While CD158b positive CD8 T-cells are likely to represent terminally differentiated T-cells, the distribution of this marker in skewed, and HCMV-specific T-cells are either underrepresented or absent in this subset. Examination of specific Vβ-families revealed in the CD158b positive population an oligoclonal distribution with expansion of certain Vβ-families. These observations are discussed considering aspects of methodology as an characteristic of the generation of memory T-cells. Therefore expression of CD158b is not simply a marker of antigen experienced CD8 T-lymphocytes. Its expression may represent different states of the development of memory T-cells. On the other hand HCMV may not be the specific antigen for the KIR-expressing T-cell subset in healthy subjects. In this context it may be interesting to investigate whether the expression of CD158b is different in healthy subjects and patients with HCMV disease or in the course of primary infection.