Recently, we employed the Co-precipitation Crosslinking Dissolution technique (CCD-technique) to fabricate biopolymer particles and to load them with riboflavin (RF). Moreover, we modified the CCD-technique by combining co-precipitation and cross-linking into one preparation step using a cross-linker, periodate-oxidized dextran (Odex). HSA and bovine haemoglobin (Hb) were used to demonstrate this technique. The haemocompatibilty of these submicron particles is important for their application as intravenously administered drug carriers. In vitro haemocompatibility assays including haemolysis test, platelet activation test, and phagocytosis test in human blood were studied. Our results showed that, both RF-HSA-MPs and Odex-HbMPs exhibited the percentage of hemolysis in the low range of 1% - 7%. Microparticle-platelet interaction did not activate the platelets and did not augment the platelet response to antagonists. The PMN phagocytes exposed to microparticles showed no phagocytic activity. These results suggested that our RF-HSA- MPs by CCD-technique and Odex-HbMPs by One-Pot formulation revealed a good hemocompatibility. Furthermore, the RF-HSA-MPs by CCD-technique were characterized showing a narrow size distribution in the range of 0.9 to 1 µm, uniform peanut-like morphology, and a zeta-potential of −15 mV. In vitro release studies represented biphasic release profiles of RF in a phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 and a cell culture medium (RPMI) 1640 medium over a prolonged period (study 1). Moreover, to assess phagocytic activity, cell surface marker, CD33 is used to identify monocytes. Here, we also investigated the CD33 expression of monocytes in human blood samples processed at different temperatures and in dependence on their phagocytic activity in the presence of opsonized Escherichia coli. The samples were then stained by fluorescently labelled anti-human CD14 and anti-human CD33 antibodies to specify the monocyte population and to evaluate CD33 expression, respectively and evaluated by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy. We found that the percentage of CD33-positive monocytes as well as their relative fluorescence intensity was up-regulated when the blood samples were kept at 37 °C or first pre-chilled at 0 °C with subsequent warming up to 37 °C, in comparison to samples kept constantly at 0 °C was significantly lower. After exposure to E. coli the CD33 relative fluorescence intensity of the monocytes activated at 37°C was 3 to 4 times higher than that of those cells kept inactive at 0 °C. Furthermore, microscopic analysis showed internalization of CD33 due to its expression on the surface and the engulfment of E. coli (study 2).
Für die Herstellung von Biopolymerpartikeln und deren Beladung mit Riboflavin (RF) wurde die Co-precipitations-Crosslinking-Dissolution-Technik (CCD-Technik) verwendet. Diese Technik wurde zu einem Einschrittverfahren modifiziert, indem als Crosslinker Periodat oxidiertes Dextran (Odex) verwendet wurde. Submikropartikel bestehend aus Humanserumalbumin (HSA-MP) und Rinderhämoglobin (HbMP) wurden hergestellt, um die Methode zu demonstrieren. Die Hämokompatibilität dieser Partikel ist für deren intravenöse Anwendung als Drug Carrier erforderlich. Die In vitro Hämokompatibilität der Partikel wurde mittels Hämolysetest, Plättchenaktivitätstests sowie des Phagozytosetest in Humanblut untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl RF-HSA-MPs als auch Odex-HbMPs eine Hämolyserate von 1 -7% aufweisen. Die Plättchen wurden durch die Mikropartikel weder aktiviert noch wurde ihre Antwort auf Agonisten beeinflusst. PMN Phagozyten zeigten bei Inkubation mit den Mikropartikeln keine Phagozytose. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die mittels CCD-Technik sowie der Einschrittformulierung hergestellten RF-HSA-MPs bzw. die Odex-HbMPs hämokompatibel sind. Die RF-HSA-MPs wurden zusätzlich hinsichtlich ihrer Größe und Form sowie ihres Zetapotentials untersucht. Sie weisen eine erdnussartige Form, eine enge Größenverteilung im Bereich von 0,9 und 1,0 μm sowie ein Zetapotential von -15 mV auf. Die Freisetzung von RF zeigt ein biphasisches Profil sowohl in Phosphatpuffer (pH 7,4) als auch in Zellkulturmedium RPMI 1640 über einen Zeitraum von mehr als 3 Tage (Studie 1). Um die Phagozytoseaktivität zu charakterisieren wurde der Oberflächenmarker CD33 für Monozyten verwendet. Dazu wurde die CD33 Expression auf humanen Monozyten in Blutproben, die bei verschiedenen Temperaturen prozessiert wurden sowie in Abhängigkeit von der Phagozytose der Monozyten in Gegenwart opsonierter Escherichia coli untersucht. Die CD33 Expression der Monoyten wurde nach deren Markierung mit CD14 und CD33 Antikörpern mittels Durchflusszytometer und Konfokalem Laserscanningmikroskop untersucht. Der prozentuale Anteil von CD33-positiven Monozyten sowie ihrer relative Fluoreszenzintensität waren hochreguliert, wenn die Blutproben bei 37°C gehalten oder erst auf 0°C abgekühlt und danach wieder auf 37°C erwärmt wurden im Vergleich zu den Proben, die konstant bei 0°C gehalten wurden. Nach Inkubation mit E. coli war die CD33 relative Fluoreszenzintensität der bei 37°C aktivierten Monozyten 3 bis 4 mal höher als bei den Zellen, die bei 0°C gehalten wurden. Die mikroskopischen Untersuchungen zeigten die Internalizierung von CD33 infolge ihrer Expression auf der Monozytenoberfläche und dem Einschluss der E. coli (Studie 2).
