One-pot Formulation of Protein Submicron Particles and Their Haemocompatibility

Abstract

Das Verfahren zur Herstellung von Proteinsubmikropartikel mittels der Coprecipitation-Crosslinking-Dissolution-Technik (CCD-Technik) besteht im wesentlichen aus drei voneinander unabhängigen Herstellungsschritten. Mit der Einführung eines makromolekularen Vernetzers, periodatoxidiertem Dextran (Odex, MG von 40 und 70 kDa), konnte die Copräzipitation und Vernetzung des Proteins in einem einzigen Schritt erfolgen. Für den Proof of Principle wurden Humanserumalbumin (HSA) und Rinderhämoglobin (Hb) verwendet. Die resultierenden Albumin-Partikel (Odex-APs) und Hämoglobin-Partikel (Odex-HbMPs) sind verformbar und weisen eine enge Größenverteilung zwischen 800-1000 nm mit einer erdnussähnlichen Form und einer negativen Oberflächenladung. Interessanterweise konnten mehr als 40% des Hb in den Odex-HbMPs über eine Lagerzeit von 90 Tagen Sauerstoff transportieren. Außerdem wurden In-vitro-Hämokompatibilitätsassays mittels Hämolysetest, indirekten Phagozytosetest und Blutplättchenaktivierungstests in menschlichem Blut, durchgeführt. Odex-APs und Odex-HbMPs verursachten keine unerwünschten Wirkungen auf die Blutzellen. Die Hämolyserate der Erythrozyten nach Kontakt mit Odex-vernetzten Proteinpartikeln war Kleiner als 5%. Deshalb können die Partikel als nicht hämolytisch betrachtet werden. Die Inkubation von Leukozyten mit Odex-APs/HbMPs beeinflusst die Phagozytose der Leukozyten nicht. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass unsere Partikel von Monozyten oder Granulozyten nicht erkannt werden. Die Exposition von Odex-APs/HbMPs verursacht bei Blutplättchen keine Aktivierung. Die Odex-APs/HbMPs verminderten weder die durch Agonisten-induzierte Blutplättchenaktivierung noch verstärkten sie dioese. Zusammenfassend zeigten Odex-vernetzte Proteinpartikel, die durch Eintopfformulierung hergestellt wurden, eine sehr gute Hämokompatibilität und stellten vielversprechende Träger für Medikamente oder Sauerstoff dar.

The coprecipitation-crosslinking-dissolution (CCD) technique for protein submicron particle fabrication consists of three independent fabrication steps. Introducing a macromolecular crosslinker, periodate-oxidised-dextran (Odex, M.W. of 40 and 70 kDa), coprecipitation and crosslinking could be performed within one step. For the proof of principle, human serum albumin (HSA) and bovine haemoglobin (Hb) were used. The resulting albumin particles (Odex-APs) and haemoglobin particles (Odex-HbMPs) are deformable and have a peanut-like shape, a narrow size distribution ranging between 800-1000 nm and a negative surface charge. Interestingly, more than 40% of Hb in the Odex-HbMPs was able to carry oxygen over a storage period of 90 days. The in vitro haemocompatibility assays included haemolysis test, indirect phagocytosis test and platelet activation tests in human blood. Odex-APs and Odex-HbMPs did not provoke any undesirable effects on the blood cells. After incubation of erythrocytes with Odex-crosslinked protein particles, the ratio of haemolysis was less than 5%. Therefore, the particles may be considered as non-haemolytic. The incubation of leukocyte with Odex-APs/HbMPs did not influence the phagocytosis of leukocyte. The results suggested that our particles were not recognized by monocytes or granulocytes. Finally, exposure of Odex-APs/HbMPs to platelets did not cause the activation of platelets. Additionally, Odex-APs/HbMPs did neither enhance nor attenuate agonist-induced platelet activation. In conclusion, Odex-crosslinked protein particles fabricated by One-pot formulation exhibited a very good haemocompatibility and represented highly promising carriers for drugs or oxygen.