Die Bedeutung von CALEB/NGC für die Ausdifferenzierung von Dendritenbäumen

Abstract

Die Dendritenbaumentwicklung von Nervenzellen ist ein komplexer Prozess, der eine entscheidende Rolle beim Aufbau des neuronalen Netzwerkes spielt. An den Dendriten ausgebildete Synapsen übertragen Informationen und regeln damit die Signalweiterleitung in der Zelle (Jan und Jan, 2003; Scott und Luo, 2001; Whitford et al., 2002). In dieser Arbeit wurde erstmals eine Funktion für das neurale EGF-Familienmitglied CALEB/NGC in der Dendritogenese gezeigt. Dieses Protein wird gehirnspezifisch exprimiert und ist vor allem in dendriten- und synapsenreichen Regionen lokalisiert. Während der Dendritendifferenzierung ist die CALEB/NGC-Expression erhöht. Als Grundlage für die hier dargestellten Untersuchungen diente das Modellsystem der primären hippocampalen Neuronenkultur. So konnte gezeigt werden, dass CALEB/NGC von hippocampalen Neuronen exprimiert wird. Die Überexpression von CALEB/NGC erhöht die Dendritenbaumkomplexität von Neuronen und nimmt dadurch direkten Einfluss auf die Morphologie von Zellen, wohingegen der „knockdown“ von endogenem CALEB/NGC mittels RNAi-Technik zu einer reduzierten Dendritenverzweigung führt. Dieses belegt die Bedeutung von endogenem CALEB/NGC für die Verzweigung von Dendriten. Ebenso führt die Überexpression eines funktionell dominant-negativ wirkenden, von CALEB/NGC-abgeleiteten Konstrukts, dessen intrazellulärer Teil vollständig fehlt, zu einer Reduktion der Komplexität von Dendritenbäumen. Mittels zweier von CALEB/NGC-abgeleiteter intrazellulärer Deletionskonstrukte konnten die intrazellulären Peptidsegmente A und B als notwendig und hinreichend für die Vermittlung der Dendritenkomplexität durch CALEB/NGC identifiziert werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die EGF- ähnliche Domäne, eine der prominentesten Regionen im extrazellulären Bereich von CALEB/NGC, nicht nur ausreichend, sondern essentiell ist, um die Dendritenkomplexität zu stimulieren. Untersuchungen zur Signaltransduktion des CALEB/NGC-vermittelten Effekts auf Dendritenkomplexität mittels pharmakologischer Inhibitoren zeigten, dass dieser nicht vom MEK-MAPK- Signalweg abhängig ist, da die CALEB/NGC-vermittelte Stimulation der Dendritenkomplexität auch unter Inhibitoreinfluss bestehen blieb. Allerdings konnte die Bedeutung eines aktiven PI3K-Akt-mTOR-Signalweges für die durch CALEB/NGC-induzierte Dendritenverzweigung gezeigt werden. Pharmakologische Inhibitoren der einzelnen Komponenten dieses Signalwegs, PI3K, Akt sowie mTOR, bewirkten die völlige bzw. partielle Inhibition der CALEB/NGC-vermittelten Dendritenkomplexität. Darüber hinaus konnte eine Abhängigkeit von PKC festgestellt werden. Außerdem konnte ich zeigen, dass CALEB/NGC die Dendritenkomplexität unabhängig von neuronaler Aktivität stimuliert. Auch unter Einfluss von Aktivitätsblockern blieb die CALEB/NGC-vermittelte Dendritenkomplexität signifikant erhöht gegenüber Kontrollzellen. In der vorliegenden Studie wurde erstmals B56β, eine regulatorische Untereinheit der Proteinphosphatase A als neuer intrazellulärer Interaktionspartner für CALEB/NGC beschrieben und mittels verschiedener biochemischer Analysen wie Blot-Overlay-Assays und Immunpräzipitationen bestätigt. Die Bindung von B56β an CALEB/NGC erfolgt über das juxtamembranäre zytoplasmatische Peptidsegment A, wie Koimmunpräzipitationen mit den von CALEB/NGC-abgeleiteten intrazellulären Deletionskonstrukten sowie Affinitätspräzipitationen und Kompetitionsstudien mit entsprechend geeigneten Peptiden zeigten. Die Interaktion beider Proteine konnte nicht nur in vitro, sondern ebenfalls in vivo in neuronalem Gewebe anhand von Immunpräzipitationen aus solubilisierten Membranfraktionen von Rattenhirn nachgewiesen werden. Um die funktionelle Auswirkung der Interaktion von B56β und CALEB/NGC zu untersuchen, wurde zunächst das endogene Expressionsmuster von CALEB/NGC und B56β in Dendriten verglichen. Die fluoreszenzmikroskopische Auswertung ergab, dass B56β, ein zytosolisches Protein, und CALEB/NGC, ein Transmembranprotein, in einzelnen diskreten Anreicherungen („Spots“) auf den Dendriten, oftmals an dendritischen Verzweigungspunkten kolokalisieren. Die Koexpression von CALEB/NGC und B56β bewirkte eine signifikante Reduktion der Anzahl dendritischer Endverzweigungen hippocampaler Neurone. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die Bedeutung von CALEB/NGC für die Entwicklung von Dendritenbäumen gezeigt. Darüber hinaus wurde B56β als neuer Interaktionspartner von CALEB/NGC identifiziert, welcher an der negativen Regulation der CALEB/NGC-vermittelten Dendritenkomplexität beteiligt ist.

The development of dendritic arbors is critical to neuronal circuit formation as dendrites are the primary sites of synaptic input (Scott and Luo, 2001; Whitford et al., 2002; Jan and Jan, 2003). In this work, the neural EGF family member CALEB/NGC was identified as a critical mediator of dendritic tree complexity. CALEB/NGC is highly expressed in brain, in particular in dendrite- and synapse-rich areas, and the expression of this protein is upregulated during times of dendrite differentiation. By means of primary hippocampal neurons in culture, a well-established model system for studying dendrite development, CALEB/NGC was shown to be expressed in hippocampal neurons and to localize to dendrites early in development. Overexpression of CALEB/NGC enhanced dendritic tree complexity, whereas reducing the endogenous expression level via RNAi-technology impaired dendritic branching. In addition, the CALEB /NGC-derived construct, which lacks the whole intracellular part, interferes in a dominant-negative manner with endogenous CALEB/NGC function. Using two different CALEB/NGC-derived intracellular deletion constructs, the intracellular peptide segments A and B were shown to be necessary and sufficient for CALEB/NGC to induce dendritic arbor complexity. Furthermore mapping experiments demonstrated that the extracellular EGF-like domain of CALEB/NGC is necessary and sufficient for increasing dendritic branching. Investigations concerning signal transduction of the CALEB/NGC-induced effect on dendritic complexity showed that the PI3K-Akt-mTOR pathway plays an important role in CALEB/NGC-mediated dendritic branching as pharmacological intervention at different steps of this pathway partially or fully inhibited the effects on dendritic tree complexity evoked by CALEB/NGC. It was also shown that a specific MEK-inhibitor did not block the CALEB/NGC-mediated dendritic branching which implies that the MEK-MAPK pathway is not involved in CALEB/NGC-induced dendritic tree complexity. PKC also participates in this process. Further studies demonstrated that CALEB/NGC is able to induce dendritic arbor complexity independtly of electrical activity. CALEB/NGC could stimulate the complexity of the dendritic tree even in the presence of activity inhibitors. Blot-overlay-assays identified B56β, a regulatory B-subunit of the protein phosphatase 2A (PP2A), as a novel intracellular interaction partner of CALEB/NGC. Interaction of B56β and CALEB/NGC in cell culture systems and neural tissue in vivo was shown by immunoprecipitations. B56β bound to the intracellular juxtamembrane peptide segment A of CALEB/NGC as was shown in vitro by coimmunoprecipitations with two different CALEB/NGC- derived intracellular deletion constructs and affinity precipitation as well as competitor studies with the respective peptides. The interaction between CALEB/NGC and B56β in vivo was confirmed by performing immunoprecipiations from solubilized membrane fractions of rat brain. Comparing the endogenous expression pattern of B56β and CALEB/NGC in primary hippocampal neurons, I found that in addition to the cell body, B56β and CALEB/NGC colocalize in discrete spots on main dendrites. Although B56β is a cytosolic protein, it is membrane-associated on dendrites, which could be due to an interaction with the transmembrane protein CALEB/NGC. Furthermore, B56β interferes with the CALEB/NGC-induced dendritic branching as was shown by functional analysis in hippocampal neurons. This work shows that dendritic branching stimulated by CALEB/NGC is dependent on active Akt. Enhanced expression of CALEB/NGC in hippocampal neurons leads to an increased phosphorylation of dendritic Akt, while coexpression of B56β completely inhibits the phosphorylation of Akt induced by CALEB/NGC. This work provides evidence that CALEB/NGC is critical for the regulation of key steps involved in generating dendritic tree complexity. In addition it was shown that B56β is a novel interaction partner of CALEB/NGC, which is involved in negative regulating CALEB/NGC-induced dendritic branching.