Charakterisierung der öffnungsabhängigen Reduktion des rHCN1-vermittelten Ih im HEK293 Modell

Abstract

HCN channels (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels) activate at hyperpolarizing voltages, and as a result of the mixed cation current (Ih) that flows through the pores of the channel, influence the synaptic and dendritic excitability, the generation of action potentials, as well as the stabilization of the resting membrane potential. Preliminary investigations showed that HCN1 channels activate more readily after being preactivated and that hyperpolarization in intact mammalian cells (HEK293) led to a reduction of the maximum Ih in cell-attached-mode (when the cell membrane is intact). This reduction was not present in whole-cell-mode (after rupturing the cell membrane), and a cAMP-related rundown (a reduction of Ih by washing out the intracellular cAMP) could not be demonstrated. These observations formed the starting point of this dissertation. The question arose as to what the causes of the reduction of the HCN1-induced Ih were. In this work, the biophysical properties of Ih after preactivation, the influence of intracellular and extracellular ion distribution on current reduction as well as the possible influence of the degradation of intracellular cAMPs on the reduction of Ih were all examined. Rat HCN1 (rHCN1) was transfected into HEK293 and electrophysiological patch-clamp-techniques were performed. The results indicate that repeated channel activity leads to a reduction in Ih and the act of repetition is more important than the strength of the preactivation. A prolongation of the preactivation alone did not lead to a reduction of the Ih. It was confirmed that the cell membrane must be intact for a reduction in amplitude. The fast current component occurring immediately (instantly) after activation of Ih (Iinst) exhibited a weaker amplitude reduction than the slow (Islow) which follows the fast current response, and there is a strong correlation between Iinst and Islow. It appears that the expression of HCN1 channels not only generates time-dependent activated channels, but also permanently-activated channels. Channel activation after preactivation is only possible again after more negative potentials. The amplitude reduction of Ih is probably the result of a change in the position of the voltage sensor, since the amplitude reduction primarily affected Islow and the gating shifted to stronger negative potentials after preactivation(s). That an amplitude reduction occurred only in the cell-attached-mode and not in the whole-cell-mode indicates that intracellular components also affect the regulation of Ih that are washed out when the cell membrane was ruptured.

HCN channels regulate neuronal excitability and activity and are involved in higher-level services such as learning and memory, as well as in complex diseases such as epilepsy and neuralgia. The HEK293 cell expression system can help to understand fundamental functions of HCN1. Further voltage-clamp-measurements in acute animal brain slices could reveal whether the data collected in this dissertation could be reproduced in higher-level cell-systems.

HCN-Kanäle (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels) öffnen bei hyperpolarisierenden Spannungen und haben mittels des durch die Kanalpore fließenden gemischten Kationenstroms (Ih) Einfluss auf synaptische und dendritische Erregbarkeit, die Generierung von Aktionspotentialen sowie auf die Stabilisierung des Ruhemembranpotentials. Untersuchungen im Vorfeld dieser Arbeit ergaben, dass sich HCN1-Kanäle leichter nach einer Voraktivierung öffnen und dass eine Hyperpolarisation in intakten Säugetierzellen (HEK293) zu einer Reduktion des maximalen Ih im cell-attached-Modus (bei intakter Membran) führte. Im whole-cell-Modus (nach Eröffnung der Zellmembran) bestand keine Reduktion und ein cAMP bedingter rundown (eine Verminderung der Stromantwort durch Auswaschung von intrazellulärem cAMP) war nicht nachweisbar. Diese Beobachtungen waren Ausgangspunkt der Dissertation. Es stellte sich die Frage, welche Ursachen die Reduktion des HCN1 vermittelten Ih hat. In dieser Arbeit wurden sowohl die biophysikalischen Eigenschaften des Ih nach stattgehabter Voraktivierung, der Einfluss der intrazellulären und extrazellulären Ionenverteilung auf die Stromreduktion als auch der mögliche Einfluss des Abbaus intrazellulären cAMPs auf die Reduktion von Ih untersucht. Ratten-HCN1 (rHCN1) wurde in HEK293 Zellen transfiziert und elektrophysiologische patch-clamp-Techniken durchgeführt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine wiederholte Kanalaktivität zu einer Reduktion von Ih führt und die Repetition der Kanalaktivierung wichtiger ist als die Stärke der Voraktivierung. Die alleinige Verlängerung der Voraktivierung führte zu keiner Reduktion von Ih. Es konnte bestätigt werden, dass für eine Amplitudenreduktion die Zellmembran intakt sein muss. Die nach der Aktivierung von Ih umgehend (intstantan) auftretende Stromkomponente (Iinst), weist eine weniger starke Amplitudenreduktion auf als die langsame (Islow), welche sich der schnellen Stromantwort anschließt und es besteht eine starke Korrelation zwischen Iinst und Islow. Die Expression von HCN1-Kanälen scheint nicht nur zeitabhängig offene Kanäle zu generieren, sondern auch ständig offene. Eine Kanalöffnung ist nach stattgehabter Voraktivierung erst wieder bei stärker negativen Potentialen möglich. Die Amplitudenminderung von rHCN1 vermitteltem Ih ist wahrscheinlich durch eine Lageveränderung des Spannungssensors bedingt, da die Amplitudenreduktion primär Islow betraf und sich das Gating nach Voraktivierung(en) zu stärker negativen Potentialen verschob. Dass eine Amplitudenreduktion nur in dem cell-attached-Modus und nicht im whole-cell-Modus eintrat, weist darauf hin, dass intrazelluläre Komponenten die Regulierung von Ih mitbeeinflussen, die beim Eröffnen der Zellmembran in die Pipette ausgespült werden. HCN-Kanäle regulieren neuronale Erregbarkeit und Aktivität und sind an übergeordneten Leistungen wie Lernen und Gedächtnis ebenso beteiligt wie an komplexen Krankheitsbildern wie der Epilepsie und Neuralgie. Das HEK293 Zellexpressionssysteme kann helfen, grundlegende Funktionen von HCN1 zu verstehen. Weiterführende voltage-clamp-Messungen in akut-animalischen Hirnschnitten können zudem zeigen, ob die in dieser Arbeit erhobenen Daten auch in übergeordneten Zellsystemen nachvollziehbar sind.