Untersuchung der Stabilität der DNA-Methylierung des POMC-Gens mittels Pyrosequenzierung von DNA aus Neugeborenenscreeningkarten und EDTA-Blutproben

Abstract

Hintergrund: In Zwillings- und Familienstudien zeigte sich eine hohe Heritabilität von Übergewicht und Adipositas. Dabei konnte die molekulare Ursache trotz umfangreicher monogenetischer Untersuchungen und genomweiter Assoziationsstudien nur unzureichend erklärt werden. Aus diesem Grunde wird untersucht, in wie weit epigenetische Modifikationen eine Rolle in der Körpergewichtsregulation spielen. Insbesondere die DNA-Methylierung, welche die Genexpression beeinflussen kann, wird dabei betrachtet. In einer Kandidatengenstudie am POMC-Gen konnte eine Assoziation von Übergewicht/Adipositas und einer vermehrten DNA-Methylierung am Intron2/Exon3-Übergang des POMC-Gens gezeigt werden. Da es nicht ausgeschlossen werden kann, dass sich die DNA-Methylierung postnatal verändert, stellt sich die Frage, ob diese POMC-Variante primär besteht oder als Folge der Adipositas sekundär postnatal entstanden ist. Ziel der Arbeit: Die epigenetische Stabilität des Intron2/Exon3-Übergangs des POMC-Gens sollte postnatal von Geburt bis ins spätere Kindes- oder Jugendalter untersucht werden. Dazu sollte zunächst die Etablierung der Pyrosequenzierung von DNA, die aus dem Trockenblut einer U2-Neugeborenenscreeningkarte gewonnen wurde, erfolgen. Methoden: Es erfolgte die Analyse der DNA-Methylierung mittels Pyrosequenzierung von Bisulfit-umgewandelter DNA gewonnen aus Neugeborenenscreeningkarten sowie EDTA-Blut, das in späterer Kindheit oder Jugend abgenommen worden war. Zur Validierung der Methodik wurde der imprintete GNASAS-Locus im Exon 1 untersucht. Am POMC-Locus wurden die CpG-Positionen des Intron2/Exon3-Übergangs analysiert. Ergebnisse: Die DNA-Methylierung von DNA gewonnen aus dem Trockenblut einer Neugeborenenscreeningkarte kann valide mittels Pyrosequenzierung analysiert werden. Die Methodik konnte anhand der Untersuchung des imprinteten GNASAS-Locus validiert werden. Dort zeigte sich an 35 Probanden eine hohe Korrelation der DNA-Methylierung der beiden untersuchten Zeitpunkte (durchschnittliches Alter bei EDTA-Blutentnahme 9,9 Jahre), was auf eine Stabilität der DNA-Methylierung in der untersuchten Region hindeutet. Die DNA-Methylierung des POMC Intron2/Exon3-Übergangs zeigte in Proben von 55 Probanden ebenfalls eine hohe Korrelation zwischen der Blutentnahme kurzzeitig nach Geburt und der im weiteren Verlauf des Lebens (durchschnittliches Alter bei EDTA-Blutentnahme 11,4 Jahre), was auf hohe Stabilität in der untersuchten Region hindeutet. Schlussfolgerung: Im Rahmen dieser Dissertation wurde gezeigt, dass die Neugeborenenscreeningkarte eingesetzt werden kann, um die Stabilität der DNA-Methylierung von Geburt bis ins spätere Leben zu untersuchen. Durch diese Methodik konnte der Beobachtungszeitraum der DNA-Methylierung im Vergleich zu bisherigen Geburtskohortenstudien signifikant erweitert werden. Die Erkenntnis, dass sich die DNA-Methylierung am POMC Intron2/Exon3-Übergang stabil darstellt, spielt eine entscheidende Rolle in der Identifikation des POMC-Gens als potentielles humanes metastabiles Epiallel. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass die POMC-Methylierungsvariante von Geburt an besteht und gegebenenfalls kausal ein Risikofaktor für die Adipositasentwicklung ist und nicht als Folge dieser angesehen werden kann.

Background: Previously, the genetic variants found in genome-wide association studies and monogenic studies could only explain the high heritability of overweight and obesity as found in family and twin studies to a little extent. This then led to the investigation of epigenetic modifications in the context of body weight regulation, in particular DNA methylation, which might affect gene expression. A candidate gene study of the POMC gene showed an association between obesity and increased DNA methylation of the POMC intron2/exon3-locus. It cannot be ruled out that DNA methylation changes over the course of life. The question remains as to whether this POMC-variant occurred postnatal as a consequence of obesity or was already present at birth. Aim of study: The aim of the study was to discover whether the POMC intron2/exon3-locus is epigenetic stable postnatal from birth until later childhood/adolescence or not. The pyrosequencing of DNA extracted from a newborn blood spot test needed to be established first. Methods: Pyrosequencing of bisulfite-treated DNA extracted from newborn blood spot tests and DNA extracted from EDTA blood samples collected later in life was conducted for DNA methylation analysis. As validation of the method exon 1 of the imprinted GNASAS gene was analyzed. CpG-Positions of the intron2/exon3-locus were analyzed for the POMC gene. Results: It was shown that DNA methylation could be validly analyzed by pyrosequencing DNA extracted from a newborn blood spot test. By showing DNA methylation stability at the imprinted GNASAS-locus, the method could be validated. For the GNASAS-locus in 35 subjects, there was a high correlation of the DNA methylation at the two analyzed points in time (mean age for EDTA blood sampling 9,9 years). Within the POMC intron2/exon3-locus in 55 subjects, there was also a high correlation of the DNA methylation at the two analyzed points in time (mean age for EDTA blood sampling 11,4 years), which indicates DNA methylation stability. Conclusion: It was shown that the newborn blood spot test can be utilized to analyze DNA methylation stability from birth until later life. With this method, the observation period of DNA methylation could be significantly extended compared to previous birth cohort studies. The finding of epigenetic stability of the POMC intron2/Exon3-locus is essential for its identification as a potential human metastable epiallele. The presence of the POMC-variant at birth implies that the methylation difference is not a consequence of obesity but could rather be a causative risk factor.