Defining the molecular cause of an altered response to anti-arrhythmic drugs in Pitx2-dependent atrial fibrillation

Abstract

Purpose: Atrial fibrillation (AF) is the most prevalent cardiac arrhythmia in humans and is associated with stroke, heart failure, hospitalisation and dementia. Genome-wide association studies (GWAS) indicate that single nucleotide polymorphisms (SNPs) on chromosome 4q25, close to the PITX2 gene, are strongly associated with AF. Hetero-zygous Pitx2c knock-out mice (Pitx2c+/-) have a shorter action potential duration (APD), a more positive resting membrane potential (RMP) and an enhanced sensitivity to flecainide. In this thesis, the causes of the modification in atrial electrophysiology and response to antiarrhythmic drug (AAD) therapy in Pitx2c+/- mice were studied. Methods: Sodium currents (INa), potassium currents (IKpeak, IKsteadystate, Ito, IK1, IKACh) and the effect of flecainide on INa were investigated using the patch-clamp technique in iso-lated left atrial (LA) cardiomyocytes from wildtype (WT) and Pitx2c+/- mice. Further-more, the effect of flecainide on human embryonic kidney cells stably expressing the human Nav1.5 sodium-channel (HEK293-hNav1.5) was assessed at different RMPs. Additionally, calcium (Ca2+) transients and the impact of flecainide were investigated in WT and Pitx2c+/- LA by high spatial resolution optical mapping. Results: There was no difference between WT and Pitx2c+/- LA cardiomyocyte cell size (measured by cell capacitance), INa density and the inhibiting effect of flecainide across a range of fixed RMPs. However, a more positive RMP increased the INa-inhibiting effect of flecainide in WT and Pitx2c+/- LA cardiomyocytes and in HEK293 cells expressing the human Nav1.5 channel. Neither Ca2+ transient duration, ampli-tude, nor the effect of flecainide were significantly different between genotypes. Flecainide shortened Ca2+ relaxation times and reduced the amplitude in both geno-types. There was no significant difference in IKpeak, IKsteadystate, Ito, IK1 and IKACh, between genotypes. A more positive RMP decreased IKpeak, IKsteadystate and Ito. IK1 remained unaf-fected by a more depolarised RMP. A modulated RMP had a dual effect on IKACh (more K+ inflow at potentials more negative to -80mV and smaller outward K+ outflouw at po-tentials above -70mV). Conclusion: Whilst the cause of the shortened APD still remains elusive, the cause of the greater antiarrhythmic effect of flecainide in Pitx2c+/- LA seems to be apparent now: The more positive RMP in LA with reduced Pitx2c+/- increases flecainide’s INa-inhibiting effect, leading to a greater antiarrhythmic protection. Thus, it is proposed that flecainide may provide more effective treatment of AF in patients with reduced PITX2.

Einleitung: Vorhofflimmern ist die häufigste kardiale Arrhythmie des Menschen und ist assoziiert mit Schlaganfällen, Herzinsuffizienz, Hospitalisierung und Demenz. Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) weisen darauf hin, dass Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) auf Chromosom 4q25 in der Nähe des PITX2 Gens stark mit Vorhofflimmern assoziiert sind. Heterozygote Pitx2c knockout Mäuse (Pitx2c+/-) präsentieren eine kürzere Aktionspotentialdauer (APD), ein positiveres Ruhemembranpotential (RMP) und eine erhöhte Sensitivität gegenüber Flecainid. In dieser Arbeit wurden die Ursachen der modifizierten atrialen Elektrophysiologie und der veränderten Reaktion auf medikamentöse antiarrhythmische (AAD) Therapie in Pitx2c+/- Mäusen untersucht. Methoden: Natriumstrom (INa), Kaliumströme (IKpeak, IKsteadystate, Ito, IK1, IKACh) und der Effekt von Flecainid auf INa wurden mittels Patch-Clamp Technik in isolierten links atrialen (LA) Kardiomyozyten von Wildtyp (WT) und Pitx2c+/- Mäusen untersucht. Außerdem wurde der Effekt von Flecainid auf humane embryonische Nierenzellen, die den humanen Nav1.5 Natriumkanal (HEK293-hNav1.5) stabil exprimieren, bei unterschiedlichen RMPs untersucht. Zusätzlich wurden Kalzium (Ca2+) Ströme und der Effekt von Flecainid auf diese in WT und Pitx2c+/- Mäusen mittels hochauflösender Optical Mapping Technik untersucht. Ergebnisse: Zwischen WT und Pitx2c+/- LA Kardiomyozyten zeigte sich kein Unterschied in Zellgröße (gemessen anhand der Zellkapazität), INa Dichte und dem hemmenden Effekt von Flecainid über mehrere RMPs. Ein positiveres RMP erhöhte den INa hemmenden Effekt von Flecainid in WT und Pitx2c+/- LA Kardiomyozyten und HEK293-hNav1.5. Weder die Dauer, noch die Höhe, noch der Effekt von Flecainid auf Ca2+ Ströme unterschieden sich signifikant zwischen den Genotypen. Flecainid verkürzte die Ca2+ Erholungszeiten und verringerte die Amplitude in beiden Genotypen. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied in IKpeak, IKsteadystate, Ito, IK1 und IKACh zwischen den Genotypen. Ein moduliertes RMP hatten einen dualen Effekt auf IKACh (mehr K+ Einfluss bei Potentialen, die negativer als -80mV sind, und weniger K+ Ausfluss bei Potentialen, die positiver als -70mV sind). Zusammenfassung: Während die Ursache für eine verkürzte Aktionspotentialdauer noch unklar bleibt, scheint der Grund für einen höheren antiarrhythmischen Effekt von Flecainid in Pitx2c+/- LA nun offen zu liegen: Das positivere RMP in LA Kardiomyozyten mit reduzierter Pitx2c Expression erhöht Flecainids INa hemmenden Effekt, was zu einem größeren antiarrhythmischen Schutz führt. Daher wird vorgeschlagen, dass Flecainid bei Patienten mit reduziertem PITX2 eine effektivere Therapie darstellt.