Identifikation und Optimierung von Liganden für die PDZ-Domänen der Proteine Shank3 und Dishevelled 3

Abstract

Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) sind für die Bildung von Proteinnetzwerken von entscheidender Bedeutung, beispielsweise in der Signaltransduktion oder der Apoptose. Die Interaktionen der Proteine werden durch PPI-Domänen realisiert. Inhibitoren von PPIs werden wie z.B. Paclitaxel bereits klinisch für die Krebstherapie eingesetzt. Außerdem sind verschiedene Krankheiten mit Fehlfunktionen im Auf- bzw. Abbau von Proteinnetzwerken assoziiert, so dass Inhibitoren für die entsprechenden PPI-Domänen einen entscheidenden Beitrag zur Aufklärung dieser Fehlfunktion bzw. zur Therapie leisten können. Eine der am weitest verbreiteten PPI-Domänen ist die Postsynaptic density 95/Discs large/Zonula occludentes-1 (PDZ)-Domäne. In dieser Arbeit wurde die PDZ-Domäne des Proteins Shank3, dem zentralen Gerüstprotein in der exzitatorischen Synapse, näher untersucht. Besonders die PDZ-Domäne ist für die Lokalisation des Proteins essenziell. Mutationen des Shank-Gens wurden im Zusammenhang mit Autismus beobachtet. Eine signifikant geringere Menge des Shank-Proteins wurde bei Alzheimerpatienten nachgewiesen. Selektive Liganden dieser PDZ-Domäne können wesentlich zur Aufklärung der Mechanismen dieser Krankheiten beitragen Um Liganden für die Shank3-PDZ-Domäne zu finden, wurde eine Fluoreszenzpolarisations-Assay etabliert und für das Screening der ChemBioNet-Bibliothek verwendet. Tetrahydrochinolinderivate wurden als aktive Verbindungen identifiziert. Die Synthese und Untersuchung einer fokussierten Bibliothek von Chinolinderivate ergab insgesamt vier aktive Verbindungen (KI = 10 – 70 µM). Die Ergebnisse der Struktur-Aktivitäts- Beziehungs-Studie konnten durch die Kristallstruktur der Shank3-PDZ-Domäne im Komplex mit einem der Tetrahydrochinolinderivate erklärt werden. Die Selektivitätsuntersuchung, durchgeführt an den PDZ-Domänen von DVL3, PSD-95 und Syntrophin, zeigte eine breite Aktivität der Chinolinderivate. Um selektivere Inhibitoren zu erhalten, wurden zusätzlich diverse Fragmente und ein Peptidmimetikum untersucht. Das Peptidmimetikum, in dem das C-terminale Carboxylat durch ein Tetrazol substituiert war, zeigte wie die Fragmente eine geringe Affinität (KI ≥ 300 µM). Das zweite untersuchte Protein, das DVL- Protein, ist ein essenzieller Teil des kanonischen Wnt-Signalwegs. Eine permanente Aktivierung dieser Signalkaskade wurde bei diversen Krebserkrankungen beobachtet. Außerdem ist bekannt, dass das Fehlen der PDZ- Domäne des DVL-Proteins den Wnt-Signalweg herunterreguliert. Inhibitoren dieser PDZ-Domäne sollten folglich den gleichen Effekt erzeugen. Aus Vorarbeiten waren Anthranilsäurederivate als Inhibitoren für die DVL3-PDZ- Domäne bekannt. Es wurden weitere Derivate synthetisiert, die KD-Werte von bis zu 7 µM aufwiesen. Für einen dieser Liganden konnte eine selektive Bindung an die DVL3-PDZ-Domäne gegenüber der DVL1-PDZ-Domäne nachgewiesen werden. Durch Kristallstrukturen von zwei Liganden jeweils im Komplex mit der DVL3-PDZ- Domäne konnte der Bindungsmodus aufgeklärt und damit eine Erklärung für die Selektivität geben werden. Abschließend ist festzuhalten, dass die Interaktion mit der Carboxylatbindungsstelle der PDZ-Domäne für die Bindung unabdingbar ist. Gelingt es zusätzliche Interaktionen, beispielsweise entlang der Peptidbindungsspalte, zu generieren, sollte eine Erhöhung der Affinität bis in den nanomolaren Bereich möglich sein.

Protein-protein interactions (PPIs) are important for the formation of protein networks, e.g. in signal transduction or apoptosis. The interactions of proteins are mediated by PPI domains. Inhibitors of PPIs, e.g. Paclitaxel are already in use for cancer therapy. Furthermore, problems concerning the formation or degradation of protein networks are interconnected to several diseases. Inhibitors for these PPI domains are useful as therapeutics as well as tool compounds to elucidate the mechanism of such diseases. One of the most widespread PPI domains is the Postsynaptic density 95/Discs large/Zonula occludentes-1 (PDZ) domain. In the present work the PDZ domain of the protein Shank3 was the subject of investigation. The Shank protein is the central scaffold protein of excitatory synapses. Especially the Shank PDZ domain is crucial for the localization of the protein within the synapse. Mutations in the Shank gene are linked to autism spectrum disorders. A significant reduction of Shank contents in the synapse is reported for Alzheimer patients. Selective inhibitors of the Shank PDZ domain could be used as tool to clarify the mechanisms of these disorders. In order to screen the ChemBioNet library a homogeneous binding assay based on fluorescence polarization was developed. The screening revealed tetrahydroquinoline derivatives as ligands for the Shank3 PDZ domain. After synthesizing and analyzing a focused library of quinoline derivatives four compounds showed activity (KI values between 10 and 70 µM) in regard to the Shank3 PDZ domain. The result of a structure activity relationship study was completely confirmed by the crystal structure of the Shank3 PDZ domain in complex with a tetrahydroquinoline derivative of the focused library. Binding studies of the active compounds using the PDZ domains of PSD-95, Dishevelled 3 (DVL3) and syntrophin were performed. All tested compounds showed bindings to several PDZ domains. To obtain selective ligands several fragments derived from a virtual screening and a screening of a fragment library were tested. Additionally a peptide analogue with a C-terminal tetrazole as a known isoster of a carboxylate was synthesized and tested. It showed as well as the fragments weak binding to the PDZ domain (peptide analogue: KI ≥ 300 µM). The DVL3 protein was the second one investigated in this work. DVL is a crucial part of the canonical Wnt signaling. A permanent activation of this signaling cascade was observed in cancer. It is known that the absence of the PDZ domain in DVL results in a down-regulation of Wnt signaling. Inhibitors of the PDZ domain should cause the same effect. From previous work, it is known that anthranilic acid derivatives are ligands for the DVL3 PDZ domain. The synthesis of derivatives revealed compounds showing KD-values up to 7 µM. One of these compounds showed selectivity towards the DVL1 PDZ domain. The crystal structures of two ligands in complex with the DVL3 PDZ domain revealed the binding mode and explained the selectivity. It can be summarized that an interaction with the carboxylate binding loop of the PDZ domain is crucial for binding of a ligand. It should be possible to generate a nanomolar affinity, if additional interactions could be produced.