Calcium-abhängige Translokation der Phospholipase C-β1a aus der Plasmamembran

Abstract

Die Phospholipase C-β1a wird nach Stimulation G-Protein-gekoppelter Rezeptoren aktiviert und katalysiert anschließend die Bildung der beiden intrazellulären second messenger Inositol-1,4,5-trisphosphat (InsP3) und Diacylglycerol. InsP3 vermittelt die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, die für die Aktivierung und Modulierung vieler weiterer intrazellulärer Prozesse und Signalkaskaden von großer Bedeutung ist. Dadurch kommt der PLC β1a eine zentrale Rolle in Calcium-vermittelten intrazellulären Signaltransduktionskaskaden zu. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die subzelluläre Lokalisation der PLC β1a und dynamische Änderungen dieser Lokalisation während intrazellulärer Signalprozesse mit Hilfe der transienten Transfektion fluoreszierender Fusionsproteine und verschiedener fluoreszenzmikroskopischer Methoden untersucht. Die Lokalisation eines Signalproteins und ihre dynamische Änderung sind wichtige Parameter für Geschwindigkeit und Effizienz der Weiterleitung eines intrazellulären Signals. Es zeigte sich, dass die primär membranlokalisierte PLC β1a durch eine Erhöhung der cytosolischen Calcium-Konzentration aus der Plasmamembran ins Cytosol transloziert. Durch Trunkierungen des Proteins mittels ortsgerichteter Mutagenese wurde die sowohl für die Membranbindung als auch für die Calcium- abhängige Translokation verantwortliche Domäne innerhalb der PLC β1a auf die Aminosäuren 903 – 1030 eingegrenzt. Darüber hinaus konnte mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Methoden der elektrostatische Charakter der PLC β1a-Membranbindung erstmals auch in lebenden Zellen nachgewiesen werden. Da Erhöhungen der cytosolischen Calcium-Konzentration, die zur Translokation aus der Plasmamembran führen auch durch die PLC β1a selbst vermittelt werden, wird die funktionelle Bedeutung dieses Effektes für die Regulation PLC β1a- vermittelter Signale diskutiert. So werden sowohl ein Modell zur negativen Rückkopplung des PLC β1a-Signals durch Calcium als auch Modelle zur Verstärkung Gαq-vermittelter Signale und zur Erzeugung von Koinzidenzsignalen unterschiedlicher Signalwege vorgeschlagen. Letztere sind von entscheidender Bedeutung für Mechanismen der neuronalen Plastizität, für die eine Beteiligung der PLC β1 in der Literatur bereits vermutet worden ist. Die Calcium-abhängige Translokation könnte somit einen neuen Mechanismus in der Feinabstimmung PLC β1a-vermittelter zellulärer Signalwege darstellen.

PLCbeta1a plays an important role in calcium signalling catalyzing the generation of the intracellular second messenger inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP3), which promotes release of Ca2+ from intracellular stores. In this thesis it is shown by imaging fluorescent fusion proteins that membrane-bound PLCbeta1a translocates to cytosol upon elevation of cytosolic Ca2+. A model of regulation of PLCbeta signalling by this mechanism is proposed. Furthermore, the membrane-binding domain of PLCbeta1a could be located to a C-terminal region (residues 903-1030).x