Post-weaning diarrhea is a widespread problem in pig rearing. Common causative agents are enterotoxigenic E. coli bacteria. Since post-weaning diarrhea is associated with a high morbidity and mortality rate, innovative prevention and therapy strategies are required. The probiotic strain E. faecium NCIMB 10415 has been demonstrated to be a promising tool to counter this disease. With regard to immunological events, host-pathogen interactions include recognition via innate immune receptors, such as NLR, some of which form inflammasomes. These multiprotein complexes license caspase-1 to process the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-18. Little is known about the involvement of inflammasome signaling pathways in post-weaning diarrhea in piglets or about the role of the NLRP3 inflammasome in promoting probiotic effects. The objective of the present work was to analyze inflammasome responses to pathogenic ETEC IMT4818 with relevance for post-weaning diarrhea and probiotic E. faecium NCIMB 10415, an authorized feed additive for sows and piglets, in in vitro and ex vivo experiments in various porcine cells and tissues. Since myeloid cells are well suited for investigations into the functions of inflammasomes, the first study of the current thesis was carried out on porcine DC derived from blood monocytes. To determine whether inflammasome signaling contributes to probiotic effects of E. faecium NCIMB 10415, porcine MoDC were pretreated with the probiotic prior to a pathogenic ETEC challenge. Moreover, inflammasome activation processes were further monitored in the presence and absence of a priming signal displayed by LPS. LPS priming induced the transcription of inflammasome components, a characteristic of the first step of inflammasome activation. Inflammasome stimulation occurred upon incubation with ETEC, but not with E. faecium. As compared with LPS-preincubated cells, the observed ETEC effects appeared at later time points when the MoDC were left unprimed. In the applied experimental setup, preincubation with probiotic E. faecium did not mediate protective effects during a pathogenic ETEC challenge via the NLRP3 inflammasome in porcine DC. In the second study, a porcine intestinal co-culture model consisting of IEC (cell line IPEC-J2) and immune cells (MoDC) was established in order to mimic the bidirectional interplay between these two cell types. The aim was to unravel any alterations in the immune response patterns of IPEC-J2 cells and DC to the added bacteria attributable to mutual IEC/immune cell interactions. In addition, the question was addressed as to which soluble factors mediate this communication. Furthermore, the expression of caspase-13 was analyzed, as it has been suggested as a potential candidate driving non-canonical inflammasome activation in pigs. MoDC revealed a more tolerogenic phenotype in the presence of IPEC-J2 cells showing attenuated inflammasome and IL-8 responses. Porcine caspase-13 was affected by bacterial incubation in each cell type. In the cell line IPEC-J2, non-canonical inflammasome signaling appeared to be initiated by ETEC infection and by co-cultivation with DC. With regard to possible mediators of IPEC-J2/MoDC crosstalk, evidence was found for TSLP secretion by IPEC-J2 cells and MoDC. The detected tolerogenic activity of co-cultured MoDC might be partly explained by an autocrine TSLP regulation in these cells. The third part of the present thesis comprises a systematic investigation in which inflammasome components have been examined in tissues from the small and large intestine of pigs at two different ages. A feeding trial was aimed at testing the impact of probiotic E. faecium on inflammasome expression in piglets. To verify the results obtained in vitro, porcine jejunal epithelia were incubated ex vivo with the aforementioned bacterial strains in mono- and coincubation setups (probiotic preincubation and a subsequent challenge with ETEC) employing the Ussing chamber technique. The systematic analysis showed that, similar to their human counterparts, the expression of certain inflammasome components (particularly NLRP6, ASC, and caspase-1) decreased gradually from the jejunum to the colon. Probiotic supplementation had only a weak impact on inflammasome expression levels. However, E. faecium was capable of reducing ETEC-triggered IL-1β protein liberation in the experiments challenging jejunal tissues. In contrast to the in vitro results, this indicated the involvement of the inflammasome pathway in probiotic effects of E. faecium NCIMB 10415. In conclusion, infection with ETEC IMT4818 caused inflammasome activation in vitro and ex vivo. The results of probiotic treatment with E. faecium NCIMB 10415 varied between in vitro and ex vivo approaches, with inflammasome-related advantageous effects being detected solely in the ex vivo study involving the ETEC challenge of porcine jejunum. In the established IPEC-J2/MoDC co-culture model, the presence of IPEC-J2 cells induced a tolerogenic phenotype in co-cultured MoDC indicating that reciprocal interactions between IEC and underlying immune cells orchestrate immunological responses.
Durchfallerkrankungen beim Absatzferkel sind ein weitverbreitetes Problem in der Schweineaufzucht. Häufige verursachende Erreger sind enterotoxische E. coli-Bakterien. Da Durchfallerkrankungen beim Absatzferkel mit einer hohen Morbiditäts- und Mortalitätsrate assoziiert ist, sind innovative Präventions- und Therapiestrategien erforderlich. Es wurde gezeigt, dass der probiotische Stamm E. faecium NCIMB 10415 ein vielversprechendes Werkzeug darstellt, diesem Erkrankungskomplex zu begegnen. Hinsichtlich der immunologischen Vorgänge kommt es im Zuge der Wechselwirkungen zwischen Wirt und Pathogen zur Erkennung durch angeborene Immunrezeptoren, wie NLR, von denen einige Inflammasome bilden. Diese Multiproteinkomplexe ermöglichen, dass Caspase-1 die pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β und IL-18 prozessiert. Es ist wenig über die Beteiligung von Inflammasom-Signalwegen bei Durchfallerkrankungen der Absatzferkel sowie über die Rolle des NLRP3-Inflammasoms bei der Vermittlung probiotischer Effekte bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in in-vitro- und ex-vivo-Versuchen mit verschiedenen porzinen Zellen und Geweben die Inflammasom-Antworten auf den pathogenen Stamm ETEC IMT4818, der bei Durchfallerkrankungen der Absatzferkel eine Rolle spielt, und das Probiotikum E. faecium NCIMB 10415, welches als Futterzusatzstoff für Sauen und Ferkel zugelassen ist, zu analysieren. Aufgrund dessen, dass sich myeloide Zellen sehr gut dazu eignen, Funktionen des Inflammasoms zu untersuchen, wurden in der ersten Studie der vorliegenden Dissertation porzine dendritische Zellen verwendet, die aus Blutmonozyten differenziert wurden. Um zu bestimmen, ob der Inflammasom-Signalweg zu den probiotischen Effekten von E. faecium NCIMB 10415 beiträgt, wurden porzine Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen (MoDC) vor der pathogenen ETEC-Challenge mit dem Probiotikum vorbehandelt. Zudem wurde die Aktivierung des Inflammasoms in der An- und Abwesenheit eines Priming-Signals, welches durch LPS vermittelt wurde, betrachtet. Das Priming mittels LPS induzierte die Transkription von Inflammasom-Komponenten, was den ersten Schritt der Inflammasom-Aktivierung darstellt. Als Folge einer Inkubation mit ETEC, nicht aber durch E. faecium, kam es zur Aktivierung des Inflammasoms. Im Vergleich zu mit LPS vorbehandelten Zellen traten die beobachteten ETEC-Effekte zu späteren Zeitpunkten auf, wenn die MoDC keinem Priming unterzogen wurden. In porzinen dendritischen Zellen vermittelte die Präinkubation mit probiotischen E. faecium-Bakterien im Rahmen der pathogenen ETEC-Challenge keine protektiven Effekte über das NLRP3-Inflammasom. In der zweiten Studie wurde ein porzines intestinales Kokultur-Modell aus intestinalen Epithelzellen (Zelllinie IPEC-J2) und Immunzellen (MoDC) etabliert, um das bidirektionale Wechselspiel zwischen diesen beiden Zelltypen nachzuahmen. Das Ziel war es, Veränderungen der immunologischen Reaktionsmuster von IPEC-J2- und dendritischen Zellen auf die zugegebenen Bakterien aufzudecken, zu denen es infolge der gegenseitigen Beeinflussung kam. Zusätzlich wurde der Fragestellung nachgegangen, welche löslichen Faktoren diese Kommunikation vermitteln. Weiterhin wurde die Expression von Caspase-13 untersucht, welche als potentieller Kandidat für die Steuerung der nicht-kanonischen Inflammasom-Aktivierung im Schwein vorgeschlagen wurde. In Anwesenheit von IPEC-J2-Zellen zeigten die MoDC einen toleranteren Phänotyp, indem sie abgeschwächte Inflammasom- und IL-8-Reaktionen aufwiesen. In beiden Zelltypen wurde die porzine Caspase-13 durch die bakterielle Inkubation beeinflusst. In der Zelllinie IPEC-J2 schien der nicht-kanonische Inflammasom-Signalweg sowohl durch eine Infektion mit ETEC, als auch durch die Kokultivierung mit dendritischen Zellen angestoßen zu werden. In Bezug auf mögliche Mediatoren der Kommunikation zwischen IPEC-J2-Zellen und MoDC wurden Hinweise für eine TSLP-Sekretion durch beide Zelltypen gefunden. Dabei könnte die Toleranzinduktion der kokultivierten MoDC zum Teil auf eine autokrine TSLP-Regulation in diesen Zellen zurückzuführen sein. Im dritten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine systematische Untersuchung von Inflammasom-Komponenten in Geweben des Dünn- und Dickdarms von Schweinen unterschiedlichen Alters durchgeführt. Ein Fütterungsversuch zielte darauf, den Einfluss des Probiotikums E. faecium auf die Inflammasom-Expression in Ferkeln zu prüfen. Um die in-vitro-Ergebnisse zu verifizieren, wurden porzine jejunale Epithelien ex vivo unter Verwendung der Ussing-Kammer-Technik mit den zuvor genannten Bakterienstämmen in Mono- und Koinkubationsansätzen (Präinkubation mit dem Probiotikum und anschließende ETEC-Challenge) inkubiert. Die systematische Analyse ergab, dass die Expression bestimmter Inflammasom-Komponenten (namentlich NLRP6, ASC und Caspase-1) ähnlich zu ihren humanen Pendants schrittweise vom Jejunum zum Kolon sank. Die Supplementierung mit dem Probiotikum hatte nur einen geringen Einfluss auf das Inflammasom-assoziierte Expressionsniveau. Jedoch waren die E. faecium-Bakterien im Rahmen der Challenge-Versuche mit Jejunumgeweben in der Lage, die ETEC-induzierte IL-1β-Proteinsekretion zu reduzieren. Im Gegensatz zu den in-vitro-Ergebnissen deutete dies an, dass der Inflammasom-Signalweg an den probiotischen Effekten von E. faecium NCIMB 10415 beteiligt ist. Als Schlussfolgerung ergab sich, dass die Infektion mit ETEC IMT4818 sowohl in vitro als auch ex vivo zur Inflammasom-Aktivierung führte. Die Resultate der probiotischen Behandlung mit E. faecium NCIMB 10415 variierten zwischen in-vitro- und ex-vivo-Ansätzen insofern, dass vorteilhafte Effekte in Verbindung mit dem Inflammasom-Weg ausschließlich in der ex-vivo-Studie gezeigt werden konnten, bei der porzines Jejunum einer ETEC-Challenge unterzogen wurde. Im entwickelten Kokultur-Modell aus IPEC-J2-Zellen und MoDC zeigte sich, dass die Anwesenheit von IPEC-J2-Zellen einen toleranten Phänotyp in kokultivierten MoDC hervorrief, was andeutete, dass reziproke Wechselwirkungen zwischen Darmepithel- und darunter liegenden Immunzellen immunologische Antworten orchestrieren.
