Non-invasive detection methods of steroids and its application in cheetahs (Acinonyx jubatus) in European zoological gardens

Abstract

In captivity, cheetahs (Acinonyx jubatus) continue to be a challenge to breed. Scientists have worked for decades to identify the underlying reasons for this problem. Until recently, it was assumed that the genetic bottleneck the cheetah population is assumed to have gone through during its history contributed to its low reproductive performance. However, studies on free-ranging populations showed that cheetahs reproduce regularly and successfully when they live in ecosystems without their main competitors, the lions (Panthera leo) and spotted hyenas (Crocuta crocuta) which kill their cubs. This is different in zoological gardens where there is no impact of competitors but where successful breeding is still a rare event. Various potential causes for this lack of apparent fertility have been suggested and investigated. One suggestion was that housing and environmental conditions in captive cheetahs may be responsible for a higher allostatic load (“stress”) in the zoo animals, which in turn might result in a low reproductive performance. However, some facilities have successfully and regularly bred cheetahs. Even if allostatic load in cheetahs under human care may be higher than in the wild, zoological gardens with high breeding success should differ in one or several factors from those with low breeding success. This dissertation was conducted to identify these factors and develop recommendations on how to improve the success of cheetah breeding programs in zoological gardens. The first step was the investigation of the allostatic load of study animals in European zoological gardens. The concentration of glucocorticoids in the body is commonly used as a biological marker of the allostatic load of vertebrates. However, the conventional procedure of collecting blood under anesthesia causes itself an immediate increase of glucocorticoids in the blood which makes an assessment of the true value impossible. In order to avoid any distortions of glucocorticoid concentrations through handling of animals, samples must be obtained in a minimally invasive manner. In feline species, feces are particularly well suited to measure glucocorticoids. Previously, there was no validated enzyme-immunoassay (EIA) available that measured and had characterised fecal glucocorticoid metabolites (fCGM) in cheetahs and that determined the affinity of the EIA. The existing radio-immunoassays (RIA) are often avoided because of the radioactivity involved in the measurements. Chapter 2 therefore presents the characterization and biological as well as technical validation of an EIA for cheetahs. The EIA demonstrated a significant increase in fGCM after experimental injection of adrenocorticotropic hormone (ACTH) in a male and a female cheetah. This experimental injection of hormones and the proof of the predicted result is called a “hormone challenge” and is equivalent to a biological validation. ACTH activates the adrenal cortex and results in a fast increase of glucocorticoids in the blood. This increase can be detected with a delay of approximately one day in the feces. Glucocorticoids such as cortisol belong to the steroid hormones. Cortisol metabolites slightly differ in their biochemical structure from other steroid hormone metabolites such as testosterone. Therefore, a clear differentiation of fGCM from other steroid hormone metabolites was essential. In chapter 3, another EIA was characterized and validated to detect testosterone metabolites in feces. It also demonstrates the differentiation between fecal testosterone metabolites (fTM) and other steroid hormone metabolites. Further, this EIA allows to conduct minimally invasive measurements on the reproductive activity of male cheetahs. The testosterone assay was also biologically validated with hormone challenges. After injection of gonadotropin releasing hormone (GnRH), an increase of fTM was detected. GnRH causes a release of gonadotropins (follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH)) in the pituitary gland. In male vertebrates, LH activates the Leydig cells in the testis and leads to an increase of testosterone in the blood. This increase was detected in the feces of cheetah males. Chapter 4 compared fGCM of reproducing and non-reproducing cheetah females in zoological gardens to examine whether they differ in their allostatic load. This was not the case. It was already known that low reproductive performance is not linked to the low genetic variability (“genetic monomorphism hypothesis”) in cheetahs nor to an endogenous seasonal trigger (“innate rhythm hypothesis”). Therefore, in this dissertation, the predictions of two other hypotheses were investigated to understand which factors might influence the reproductive success of female cheetahs. The hypotheses investigated were (1) a lack of reproduction because of reproductive suppression by conspecifics, (2) a lack of reproduction because of the faster ageing of inner reproductive organs (ARA = asymmetric reproductive aging) in those females which did not reproduce early in their life. The life history data on reproducing and non-reproducing female cheetahs in five European zoological gardens were consistent with the predictions by both hypotheses. The discussion of the entire thesis and its scientific results is compiled in chapter 5. It also introduces recommendations for zoological gardens and the European breeding program (EEP) to improve the reproductive success of this species in the future and make reproductive failure of cheetah part of history.

Die bisherigen Erfolge in der Züchtung von Geparden (Acinonyx jubatus) in menschlicher Obhut sind bis heute nicht zufriedenstellend. Seit Jahrzehnten wird an den Ursachen dieser Problematik geforscht. Bis vor kurzem ging man noch davon aus, dass der genetische Flaschenhals, durch den die Population entstehungsgeschichtlich gegangen ist, maßgeblichen Anteil an dem Phänomen hat. Untersuchungen im Freiland zeigten jedoch, dass freilebende Geparde regelmäßig und problemlos reproduzieren, wenn sie in Ökosystemen leben, in denen keine Löwen (Panthera leo) und Tüpfelhyänen (Crocuta crocuta) vorkommen, die ihre Jungtiere töten. Davon unterscheiden sich die Populationen in den Zoos weltweit entscheidend. Hier kommt es selten zu erfolgreichen Nachzuchten, obgleich Löwen und Tüpfelhyänen als Mortalitätsursache der Jungtiere ausscheiden. Verschiedene Gründe wurden hierfür untersucht. Unter anderem wurde vermutet, dass die unterschiedlichen Lebenssituationen der Tiere im Freiland und in Zoos zu einer unterschiedlichen Belastung führen, und somit die erhöhte Allostase („Stress“) in begrenzter und gemanagter Umgebung zu einer schlechteren Reproduktion führt. Allerdings gelingt es einigen Einrichtungen immer wieder verlässlich, mit Geparden Nachzuchterfolge zu erzielen. Auch wenn die Stressbelastung in zoologischen Gärten höher als im Freiland sein sollte, ist zu erwarten dass sich die erfolgreich züchtenden Haltungen in einem oder mehreren Faktoren von den nicht erfolgreich züchtenden Haltungen unterscheiden. Diese Dissertation wurde durchgeführt, um diese Faktoren zu ergründen und gegebenenfalls Empfehlungen zur besseren Erhaltungszucht dieser bedrohten Tiere in Zoos zu ermöglichen. Hauptaugenmerk lag auch in dieser Arbeit zuerst auf der Untersuchung der allostatischen Belastung der Zootiere. Die Konzentration von Glukokortikoiden im Körper wird gewöhnlich als ein Maß für den Stress bei Wirbeltieren verwendet. Blutabnahmen unter Narkose führen allerdings binnen kürzester Zeit zu einer akuten Erhöhung dieser Hormone im Blut, die keinen Rückschluss auf vorausgehende Werte mehr zulassen. Daher sollte die Probennahme berührungsfrei erfolgen, um Handling-Effekte bei der Messung der Glukokortikoid-Messwerte zu vermeiden. Hierzu eignet sich bei Katzen besonders der Kot, um die Metabolite der Glukokortikoide zu messen. Bisher gab es keinen für Geparde validierten Enzyme-Immunoassay (EIA), der die fäkalen Glukokortikoid-Metabolite (fGCM) messen konnte und sie auch charakterisierte, sowie die Affinität des EIA bestimmte. Die vorhandenen Radio-Immunoassays (RIA) werden auf Grund der Radioaktivität oft nur ungern eingesetzt. Daher wurde in Kapitel 2 ein neuer EIA für Geparde entwickelt und technisch wie biologisch validiert und charakterisiert. Der EIA dokumentierte erfolgreich eine erhöhte Konzentration von fGCM nach der experimentellen Zuführung von adrenocorticotropen Hormon (ACTH) bei einem männlichen und einem weiblichen Gepard. Diese experimentelle Zuführung von Hormonen mit dem Nachweis eines erwarteten Ergebnisses wird als „Hormonchallenge“ bezeichnet und ist die hierfür allgemein akzeptierte Form einer biologischen Validierung. ACTH führt über eine Aktivierung der Nebennierenrinde zu einem schnellen Anstieg von Glukokortikoiden im Blut. Dieser Anstieg ist mit Verzögerung von etwa einem Tag dann auch im Kot nachweisbar. Glukokortikoide (wie z.B. Cortisol) gehören zu den Steroidhormonen. Da sich Cortisol-Metabolite nur unwesentlich von anderen Steroidhormon-Metaboliten (wie z.B von Testosteron) unterscheiden, war eine eindeutige Abgrenzung zu den fGCM im Kot wichtig. Kapitel 3 beschreibt einen zweiten entwickelten EIA, der Testosteron-Metabolite im Kot detektiert. Dieser unterstreicht nicht nur die gut trennbare Messung von Testosteron-Metaboliten zu anderen Steroidhormon-Metaboliten, sondern könnte in Zukunft auch Aussagen über die reproduktive Aktivität männlicher Tiere berührungsfrei erlauben. Auch der Testosteronassay wurde mit Hormonchallenges biologisch validiert. So wurde ein erhöhter Testosteronanstieg nach der Injektion von Gonadotropinreleasinghormon (GnRH) nachgewiesen. GnRH bewirkt in der Hypophyse eine Freisetzung von Gonadotropinen (Follikel stimulierendes Hormon (FSH), Luteinisierndes Hormon (LH)), die wiederum auf die Geschlechtsorgane wirken. LH bewirkt beim männlichen Säuger durch Aktivierung der Leydig-Zellen der Hoden u.a. einem Anstieg von Testosteron im Blut. Dieser war im Kot nachweisbar. Kapitel 4 verglich fGCM von reproduzierenden und nicht reproduzierenden weiblichen Geparden, um zu untersuchen, ob die beiden Gruppen unterschiedliche Stresswerte aufwiesen, was nicht der Fall war. Es war zudem bereits bekannt, dass Schwierigkeiten in der Reproduktion in menschlicher Obhut auch nicht durch die geringe genetische Variabilität der Geparde verursacht wurde und es keine(n) endogene(n) jahreszeitlichen Umweltsignale (Zeitgeber) gibt, der/die die Reproduktion auslöst/en. Daher wurden die Vorhersagen zweier weiterer Hypothesen untersucht, um zu verstehen, welche Faktoren einen Einfluss auf den Fortpflanzungserfolg von Gepardenweibchen haben könnten. Dies waren die Hypothesen (1) fehlende Fortpflanzung aufgrund der reproduktiven Unterdrückung durch Artgenossen, 2) fehlende Fortpflanzung aufgrund der beschleunigten Alterung der inneren Geschlechtsorgane (ARA = asymmetric reproductive aging) bei Weibchen, die sich nicht in jungen Jahren fortpflanzen. Die lebensgeschichtlichen Daten bezüglich der reproduzierenden und nicht reproduzierenden weiblichen Geparde in fünf zoologischen Gärten in Europa sind mit den Vorhersagen beider Hypothesen kompatibel. Die Diskussion der gesamten Doktorarbeit und der neuen Erkenntnisse behandelt Kapitel 5. Darin werden auch Empfehlungen für die zoologischen Gärten und das europäische Erhaltungszuchtprogramm (EEP) vorgestellt, damit in Zukunft die unbefriedigenden Nachzuchterfolge dieser Spezies der Vergangenheit angehören.