Evaluation of udder firmness and fecal cortisol metabolites as cow-side parameters in dairy cows

Abstract

Animal welfare issues of food-producing animals are of increasing significance both in research and to the general public. As a result, there is a pressing need for the evaluation of non-invasive, practical, cow-based and standardized parameters to objectively measure animal welfare and stress in dairy cows on- farm. Data regarding validity and reliability of these measures is crucial. A high level of standardization in parameter measurement also leads to a more specific and optimized treatment of a disease. The focus of this work was to evaluate non-invasive cow-side parameters to objectively verify clinical mastitis (CM) via udder firmness and heat stress via fecal glucocorticoid metabolites (11,17-dioxoandrostanes; 11,17-DOA). Both CM and heat stress negatively affect the welfare of dairy cows, result in behavioral changes such as lowered lying time and impair the reproductive performance. Furthermore, both cause substantial economic losses. Therefore, these topics are highly important for the dairy industry and intensively investigated. Assessment of udder firmness is an essential part of a sound clinical examination of a dairy cow and a practical tool to detect CM promptly. Therefore, validity and reliability of estimates of udder firmness generated by palpation and by using a validated dynamometer in healthy lactating dairy cows was evaluated in the first study. Specifically, this study set out to determine within-observer repeatability and between-observer repeatability expressed as the intraclass correlation (ICC) in two specific experiments. Additionally, a 4-point palpation scoring system was compared with estimates obtained with a dynamometer. First, the range of udder firmness of 25 cows was determined and an in-vitro model for udder firmness was developed in a pilot trial. This model enabled training of the observers and allowed investigating a 4-point palpation scoring system. In vivo, udder firmness was determined before and after milking by palpation and by using a dynamometer. In experiment 1, within-observer repeatability based on estimates of udder firmness of 25 cows obtained by three observers on a single day (n = 500) by palpation was 0.968 [95% confidence interval (CI): 0.960 to 0.975]. Within-observer repeatability of these estimates of udder firmness obtained with the dynamometer was 0.997 (95% CI: 0.996 to 0.998) with a coefficient of variation of 9.1% (mean + SD: 1.176 + 0.107 kg). To determine between-observer repeatability, udder firmness of 100 cows was measured on four different days by nine observers in experiment 2. Considering all measurements (n = 1,800), between-observer repeatability of estimates of udder firmness obtained by palpation and the dynamometer was 0.932 (95% CI: 0.917 to 0.945) and 0.898 (95% CI: 0.867 to 0.925), respectively. Thus, udder firmness in dairy cows could be measured repeatably with both methods, especially when performed by a single observer. Estimates of udder firmness generated by palpation and with the dynamometer were moderately related (correlation coefficient: 0.54; n = 3,600; P < 0.001). Training of observers through the pilot trial or practical experience in the four days of the study in experiment 2 did not improve the correlation. As only healthy cows were included in this first study, further research was warranted to understand how udder firmness develops in infected udders. Therefore, a follow-up study (additional unpublished work, second study) focused on udder firmness in cows suffering from CM. Swelling and an increased firmness of the mammary gland is an important sign to detect mastitis in dairy cows. The overall objective of this study was to evaluate if udder firmness can be used as a cow-side indicator for CM. The dynamometer was used to objectively determine udder firmness before and after milking in 45 cows with CM and 95 healthy cows. Udder firmness of both hind quarters was measured daily on three locations (upper, middle, lower measuring point) from the day of mastitis diagnosis till day 7 and again on day 14. Firmness of the middle measuring point was highest before and after milking in all cows (P < 0.001). Udder firmness before milking was similar (P = 0.675) in quarters without [1.867 kg, interquartile range (IQR): 1.243 to 2.671 kg; n = 6,340] and with CM (1.948 kg, IQR: 1.213 to 2.819 kg; n = 1,220). Subsequently, we concentrated on firmness measured on the middle point after milking. After milking, quarters with CM were firmer than healthy quarters (P < 0.001). An increase of firmness in a quarter with CM did not affect firmness in the healthy neighbor quarter (P = 0.419) nor did firmness of all healthy quarters differ (P = 0.349 to 0.931). To reduce grouping of data (data clustering), one firmness value per cow i.e., Δ firmness (difference in udder firmness between both hind quarters), was used for all further calculations. In all cows, CM affected Δ firmness significantly. More precisely, Δ firmness differed between cows without (0.098 kg, IQR: 0.030 to 0.216 kg) and with CM (0.756 kg, IQR: 0.170 to 1.914 kg; P < 0.001). In cows in their second and greater parity, Δ firmness was also significantly affected by milk yield per day and DIM. The threshold for detection of CM using Δ firmness was 0.282 kg (area under the curve: 0.722; sensitivity: 64.3%, specificity: 89.7%) and 0.425 kg (area under the curve: 0.817; sensitivity: 62.5%, specificity: 96.7%) in cows in their first parity and older cows, respectively. Cows with CM had a higher Δ firmness compared to cows without CM throughout the 14 days after the mastitis diagnoses (P < 0.001). Parity had an effect on Δ firmness (P = 0.016). Depending on the absence or presence of systemic signs of sickness, cows with CM were classified into cows with mild to moderate (n = 21) or severe CM (n = 24). Bacteriological and clinical cure was defined based on two bacteriological negative milk samples taken at day 7 and 14 after enrollment and normal appearance of milk on the same days. Cows with severe CM suffered from a firmer udder on all measuring days (P < 0.001). An effect of parity (P = 0.140) and bacteriological cure (P = 0.262) on Δ firmness did not exist. Cows not clinically cured showed an increased Δ firmness of 0.560 kg compared to cured cows (P < 0.001). In conclusion, udder firmness can be a useful indicator for CM in hind quarters. Further research is warranted to evaluate if firmness estimated by palpation and firmness in front udders could also be used as an indicator for CM. It also remains unclear if udder firmness can be used as a predictor for the prognosis of a CM. Measurement of fecal cortisol metabolites in fecal samples is a scientifically established and practical method to determine stress levels in animals. In dairy cows, fecal cortisol metabolites have already been used as an indicator for stress during the transition period, dry-off, handling and transport. In this thesis, the focus is on a new field of application of measurement of fecal cortisol metabolites i.e., measurement of heat stress. The negative impact of heat stress on health and productivity of dairy cows is well known. Heat stress can be quantified with the temperature-humidity-index (THI) and is defined as a THI > 72. For aforementioned reasons, finding a way to quantify heat stress in dairy cows has been of increasing interest over the past decades. Therefore, the objective of the third study of this thesis was to evaluate concentrations of fecal glucocorticoid metabolites (i.e., 11,17-dioxoandrostanes; 11,17-DOA) as an indirect stress parameter in dairy cows without heat stress (DOA 0), with heat stress on a single day (acute heat stress; DOA 1) or with more than a single day of heat stress (chronic heat stress; DOA 2). Cows were housed on five farms under moderate European climates. Two statistical approaches (approach 1 and 2) were assessed. Using approach 1, concentrations of fecal 11,17-DOA were compared among DOA 0, DOA 1 and DOA 2 samples regardless of their origin (i.e., cow) using an unpaired test. Using approach 2, a cow was considered as its own control i.e., 11,17-DOA were treated as a cow-specific factor and only paired samples were included in the analysis for this approach (paired tests). In approach 1 (P = 0.006) and approach 2 (P = 0.038) 11,17-DOA values of cows under acute heat stress were higher compared to those of cows without heat stress. Therefore, the hypothesis could be confirmed that acute heat stress is associated with higher fecal 11,17-DOA concentration. This was, however, not the case in cows under chronic heat stress as concentrations of fecal 11,17-DOA in cows without and with chronic heat stress did not differ. Results of this study indicate that acute heat stress has to be considered as a confounder in studies measuring fecal glucocorticoid metabolites in cows to evaluate other stressful situations. Regarding the overall hypothesis of my thesis, validity of both parameters was verified. Udder firmness can be measured repeatably and provides a feasible and easy-to-use indicator for CM. To optimally diagnose CM, udder of cows should be examined after milking in the middle or lower part of a given udder quarter. Furthermore, different udder firmness thresholds should be used to diagnose CM in first-parity or older cows. Concentrations of fecal glucocorticoid metabolites were proven to be affected by acute heat stress. Overall, results of the three studies add one part to the improvement of objective cow-side tests to detect important conditions negatively affecting animal welfare of dairy cows.

Das Wohlergehen lebensmittelliefernder Tiere ist sowohl in der Forschung als auch für die Öffentlichkeit von zunehmender Bedeutung. Daher besteht eine zwingende Notwendigkeit zur Evaluierung geeigneter, kuhbasierter und standardisierter Parameter zur objektiven Messung von Tierwohl und Stress bei der Milchkuh direkt auf dem Betrieb. Daten zu Validität und Zuverlässigkeit dieser Messungen sind essentiell. Ein hohes Maß an Standardisierung führt auch zu spezifischeren und optimierten Behandlungen von Erkrankungen. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Evaluierung nicht-invasiver und kuhbasierter Parameter, um klinische Mastitis (CM) mittels Euterfestigkeit und Hitzestress mithilfe von im Kot nachweisbaren Kortisolmetaboliten (11,17-Dioxoandrostane; 11,17-DOA) objektiv zu messen. Sowohl CM als auch Hitzestress haben einen negativen Effekt auf das Tierwohl der Milchkühe, führen zu Verhaltensveränderungen wie beispielsweise Verringerung der Liegezeit und beeinträchtigen die Reproduktionsleistung. Zusätzlich führen beide zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten. Daher sind sie von hoher Wichtigkeit für die Milchindustrie und werden intensiv erforscht. Beurteilung der Euterfestigkeit ist essentieller Bestandteil einer sorgfältigen klinischen Untersuchung der Milchkuh und eine geeignete Methode zur direkten Erkennung der CM. Aus diesem Grund wurden Validität und Zuverlässigkeit von Messungen der Euterfestigkeit gesunder laktierender Milchkühe mittels Palpation und einem validiertem Dynamometer in einer ersten Studie evaluiert. Dazu wurde die Wiederholbarkeit von Messungen innerhalb eines Untersuchers und zwischen verschiedenen Untersuchern in zwei Experimenten bestimmt und durch den Intraklassen-Korrelationskoeffizient (ICC) ausgedrückt. Zusätzlich wurde eine 4-Punkte-Palpationsskala mit den durch das Dynamometer ermittelten Werten verglichen. Zunächst wurde im Rahmen einer Pilotstudie der Wertebereich der Euterfestigkeit bei 25 Kühen bestimmt und ein In-vitro-Euterfestigkeitsmodell entwickelt. Dieses Modell ermöglichte ein Training der Untersucher und erlaubte die Entwicklung einer 4-Punkte-Palpationsskala. Die Euterfestigkeit wurde in vivo durch Palpation und Dynamometer vor und nach dem Melken gemessen. In Experiment 1 betrug die Wiederholbarkeit von Euterfestigkeitsmessungen innerhalb eines Untersuchers, die mittels Palpation bei 25 Kühen und durch drei Untersucher an einem einzelnen Tages durchgeführt wurden (n = 500), 0,968 [95% Konfidenzintervall (CI): 0,960 bis 0,975]. Die Wiederholbarkeit dieser Messungen der Euterfestigkeit mit dem Dynamometer innerhalb eines Untersuchers war 0,997 (95% CI: 0,996 bis 0,998) und wies einen Variationskoeffizient von 9,1% (Mittelwert + Standardabweichung: 1,176 + 0,107 kg) auf. Um die Wiederholbarkeit von Messungen zwischen verschiedenen Untersuchern zu ermitteln, wurde in Experiment 2 die Euterfestigkeit bei 100 Kühen an vier verschiedenen Tagen durch neun Untersucher gemessen. Unter Berücksichtigung aller Messungen (n = 1.800), betrug die Wiederholbarkeit der Messungen mittels Palpation zwischen den Untersuchern 0,932 (95% CI: 0,917 bis 0,945) und 0,898 (95% CI: 0,867 bis 0,925) bei Messungen mit dem Dynamometer. Folglich konnte die Euterfestigkeit bei Milchkühen, vor allem wenn sie durch einen einzelnen Untersucher ermittelt wurde, durch beide Methoden wiederholbar gemessen werden. Euterfestigkeitswerte, welche durch Palpation und Dynamometer ermittelt wurden, waren mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,54 (n = 3.600; P < 0,001) moderat korreliert. Diese Korrelation konnte durch einen Trainingseffekt durch die Pilotstudie oder praktische Erfahrung in den vier Tagen der Studie nicht verbessert werden. Da in dieser Studie ausschließlich gesunde Kühe untersucht wurden, war eine weitere Studie zur Entwicklung der Euterfestigkeit in entzündeten Eutervierteln notwendig. Daher lag der Schwerpunkt einer Folgestudie (zusätzliche unveröffentlichte Daten, zweite Studie) auf der Untersuchung der Euterfestigkeit bei Kühen, die an CM erkrankt waren. Die Schwellung und Verfestigung der Milchdrüse gehört zu den klassischen Entzündungszeichen einer Mastitis und ist daher ein wichtiger Befund zur Erkennung der CM in Milchkühen. Das Hauptziel dieser Studie war es, Euterfestigkeit als einen kuhbasierten Indikator für CM zu validieren. Dazu wurde bei 45 Kühen mit CM und bei 95 gesunden Kühen die Euterfestigkeit vor und nach dem Melken mit dem Dynamometer gemessen. Die Festigkeit beider Hinterviertel wurde täglich an je drei Punkten (oberer, mittlerer und unterer Messpunkt) beginnend am Tag der Mastitisdiagnose (Tag 0) bis zum Tag 7 und an Tag 14 gemessen. Die Festigkeit des mittleren Messpunktes war bei allen Kühen sowohl vor als auch nach dem Melken am höchsten (P < 0,001). Vor dem Melken glich sich die Euterfestigkeit gesunder [1,867 kg, Interquartilsabstand (IQR): 1,243 bis 2,671 kg; n = 6.340] und erkrankter Viertel (1,948 kg, IQR: 1,213 bis 2,819 kg; n = 1.220; P = 0,675). Für die weitere Auswertung wurde ausschließlich die nach dem Melken gemessene Festigkeit des mittleren Messpunktes berücksichtigt. Nach dem Melken waren an CM erkrankte Viertel fester als gesunde (P < 0,001). Die Festigkeit aller gesunden Viertel unterschied sich nicht (P = 0,349 bis 0,931) und wurde nicht durch die Verfestigung des entzündeten Nachbarviertels beeinflusst (P = 0,419). Um die Gruppierung von Daten (Datencluster) zu reduzieren, wurde für alle folgenden Berechnungen ausschließlich ein einziger Festigkeitswert pro Kuh, Δ Festigkeit (Differenz der Euterfestigkeit zwischen beiden Hintervierteln in kg), verwendet. Bei allen Kühen beeinflusste eine CM die Δ Festigkeit signifikant. Genauer gesagt unterschied sich Δ Festigkeit von gesunden (0,098 kg, IQR: 0,030 bis 0,216 kg) und erkrankten Kühen (0,756 kg, IQR: 0,170 bis 1,914 kg; P < 0,001). Bei Kühen in der zweiten oder höheren Laktation wurde Δ Festigkeit weiterhin durch die Tagesmilchleistung und die Tage in Milch signifikant beeinflusst. Der Grenzwert für die Erkennung einer CM mittels Δ Festigkeit betrug 0,282 kg (Fläche unter der Kurve: 0,722; Sensitivität: 64,3%, Spezifität: 89,7%) für Erstlaktierende und 0,425 kg (Fläche unter der Kurve: 0,817; Sensitivität: 62,5%, Spezifität: 96,7%) für Kühe in der zweiten oder höheren Laktation. Kühe mit CM hatten im Verlauf der 14 Tage nach der Mastitisdiagnose stets eine höhere Δ Festigkeit als gesunde Kühe (P < 0,001). Die Laktationszahl beeinflusste auch hier Δ Festigkeit (P = 0,016). In Abhängigkeit von dem Vorhandensein systemischer Krankheitsanzeichen wurden die an CM erkrankten Kühe aufgeteilt in Kühe mit milder und moderater (n = 21) oder Kühe mit schwerer CM (n = 24). Kühe mit CM, bei denen zwei bakteriologisch negative Milchproben an Tag 7 und 14 gewonnen wurden, galten als bakteriologisch geheilt. Als klinisch geheilt galten Kühe, die an diesen Tagen keinerlei Abweichungen vom Milchcharakter aufwiesen. Kühe mit schwerer CM litten an allen Messtagen an einem festeren Euter (P < 0,001). Ein Effekt der Laktationszahl (P = 0,14) oder der bakteriologischen Heilung (P = 0,262) auf Δ Festigkeit konnte nicht festgestellt werden. Kühe ohne klinische Heilung hatten eine um 0,560 kg höhere Δ Festigkeit als klinisch geheilte Kühe (P < 0,001). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Euterfestigkeit ein geeigneter Indikator zur Erkennung der CM in den Hintervierteln darstellt. Weiterführende Untersuchungen sind nötig um zu eruieren, inwiefern die Festigkeit der Vorderviertel sowie die durch Palpation gemessene Festigkeit zur Erkennung einer CM genutzt werden kann. Weiterhin unklar ist auch, inwiefern Euterfestigkeit als prädiktive Größe für die Prognose einer CM genutzt werden kann. Die Messung von Kortisolmetaboliten in Kotproben ist eine wissenschaftlich etablierte und praktikable Methode für die Bestimmung von Stresszuständen in Tieren. Im Kot nachweisbare Kortisolmetabolite wurden bereits dazu genutzt, Stress bei Milchkühen während der Transitperiode, während des Trockenstellens, beim Handling und beim Transport nachzuweisen. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Messung von Hitzestress mittels der Konzentration von Kortisolmetaboliten im Kot, einem neuen Anwendungsgebiet dieser Methode. Der negative Einfluss von Hitzestress auf die Gesundheit und Leistung von Milchkühen ist gut beschrieben. Hitzestress wird durch den Temperatur-Feuchtigkeits-Index (THI) quantifiziert und ist dann definiert als ein THI > 72. Aus oben genannten Gründen besteht seit einigen Jahrzehnten wachsendes Interesse an der Quantifizierung von Hitzestress. Daher bestand das Hauptziel der dritten Studie dieser Arbeit darin, die Konzentration von Glukokortikoidmetaboliten im Kot (11,17-Dioxoandrostane; 11,17-DOA) als einen indirekten Stressparameter bei Milchkühen ohne Hitzestress (DOA 0), mit Hitzestress an einem einzigen Tag (akuter Hitzestress, DOA 1) oder mit über einem Tag Hitzestress (chronischer Hitzestress, DOA 2) zu evaluieren. Die Kühe wurden auf fünf Betrieben und unter gemäßigtem europäischem Klima gehalten. Zwei statistische Ansätze (Ansatz 1 und 2) wurden angewandt. In Ansatz 1 wurden die 11,17-DOA-Konzentrationen im Kot zwischen DOA 0-, DOA 1- und DOA 2-Proben ungeachtet ihrer Herkunft (Kuh) mittels ungepaartem Test verglichen. Für Ansatz 2 wurde jede Kuh als ihre eigene Kontrolle berücksichtigt. Folglich wurde 11,17-DOA als kuhspezifischer Faktor behandelt und ausschließlich gepaarte Stichproben in die Berechnungen für diesen Ansatz mit einbezogen (gepaarter Test). Die 11,17-DOA-Konzentration bei Kühen unter akutem Hitzestress war im Vergleich zu Kühen ohne Hitzestress sowohl in Ansatz 1 (P = 0,006) als auch in Ansatz 2 (P = 0,038) erhöht. Somit konnte die Hypothese bestätigt werden, dass akuter Hitzestress mit einer erhöhten Konzentration von Kortisolmetaboliten im Kot assoziiert ist. Dies war nicht der Fall bei Kühen, die unter chronischem Hitzestress litten, da sich die 11,17-DOA-Konzentration von Kühen ohne und unter chronischem Hitzestress nicht unterschied. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass in Studien, welche die Messung von Kortisolmetaboliten im Kot nutzen um Stress zu quantifizieren, akuter Hitzestress als Störvariable berücksichtigt werden sollte. In dieser Arbeit konnte die Zuverlässigkeit sowohl von Euterfestigkeit als auch von Kortisolmetaboliten im Kot als kuhbasierte Parameter validiert werden. Euterfestigkeit kann wiederholbar gemessen werden und stellt einen praktikablen und einfach zu nutzenden Indikator für CM dar. Um CM optimal diagnostizieren zu können, sollte das Euter nach dem Melken und am mittigen oder unteren Teil des jeweiligen Viertels untersucht werden. Zusätzlich sollten zur Diagnose der CM unterschiedliche Euterfestigkeitsgrenzwerte bei Erstlaktierenden und älteren Kühen genutzt werden. Ein Einfluss von akutem Hitzestress auf die Konzentration von Kortisolmetaboliten im Kot konnte nachgewiesen werden. Zusammenfassend tragen alle drei Studien zur Verbesserung objektiver kuhbasierter Tests bei, um wichtige Zustände, die das Wohlbefinden von Milchkühen beeinträchtigen, zu erfassen.