Untersuchungen zur Regulation der Prostaglandinsynthese im bovinen Ovidukt

Abstract

Das Ovidukt spielt eine entscheidende Rolle im Reproduktionsgeschehen. Es stellt die optimalen Umweltbedingungen für die Eizellreifung, die Spermienkapazitation, den Gametentransport, die Befruchtung und die frühe Embryonalentwicklung zur Verfügung. Hierbei handelt es sich um Schlüsselprozesse bei der Entstehung der Trächtigkeit. Viele dieser Prozesse werden durch Hormone wie beispielsweise Sexualsteroide oder Prostaglandine reguliert oder beeinflusst. Insbesondere die Prostaglandine werden als zentrale Mediatoren im Verlauf der Ovulation, der Befruchtung und der Entstehung und Aufrechterhaltung der Trächtigkeit vermutet und wurden bereits im bovinen Ovidukt nachgewiesen. Um einen genaueren Einblick in die Regulation der Prostaglandinsynthese des bovinen Ovidukt zu erhalten, sollten die zyklusabhängigen Veränderungen und lokalen Verteilungen der Enzyme der Prostaglandinsynthesekaskade sowohl auf mRNA- als auch zum Teil auf Proteinebene untersucht werden. Das bovine Untersuchungsmaterial stammte aus dem Schlachthof und wurde in die vier folgenden Zyklusphasen eingeteilt: prä- (Tag 19-21) und postovulatorische Phase (Tag 1-5) sowie frühe (Tag 6-12) und späte Lutealphase (Tag 13-18). Zusätzlich wurde in ipsi- und kontralaterales Ovidukt unterschieden und das einzelne Ovidukt weiter in Ampulle und Isthmus geteilt. In den durch Spülen der Oviduktabschnitte gewonnenen Oviduktzellen wurde die mRNA Expression der folgenden an der Prostaglandinsynthese beteiligten Enzyme mittels quantitativer RT-PCR gemessen: sPLA2, cPLA2α, cPLA2β, COX-1, COX-2, cPGES, mPGES-1, mPGES-2, PGFS, HSD, H-PGDS, L-PGDS und PGIS. Die Transkripte aller untersuchten Enzyme konnten im bovinen Ovidukt nachgewiesen werden. In der postovulatorischen Phase, in der die meisten der oben genannten Prozesse stattfinden, zeigten COX-1, mPGES-1, HSD, PGFS und H-PGDS ihre höchsten Expressionen während des Zyklus. Die höchste Expression von cPLA2β und PGIS wurde in der präovulatorischen Phase und die von L-PGDS in der späten Lutealphase detektiert. Eine zyklusunabhängige Expression zeigten dagegen sPLA2, cPLA2α, COX-2, cPGES und mPGES-2. Auffällig waren lokale Expressionsunterschiede innerhalb der Ovidukte: sPLA2, L-PGDS und PGIS wurden in der Ampulle höher als im Isthmus und mPGES-1 und HSD im Isthmus höher als in der Ampulle exprimiert. Unterschiede zwischen den Oviduktabschnitten der ipsi- und kontralateralen Ovidukte wurden nicht gefunden. In Western Blot Analysen wurde der Proteingehalt der Cyclooxygenasen ebenfalls in Abhängigkeit von Zyklusphase und Ort im Ovidukt bestimmt. Es zeigte sich, dass COX-1 in der frühen Lutealphase in größeren Mengen vorkam als in den anderen Zyklusphasen, COX-2 zeigte dagegen eine einheitliche Expression ohne erkennbare Regulation im Zyklusverlauf. Die Durchführung eines Cyclooxygenase-Aktivitätstests zeigte, dass COX-1 den Hauptanteil zur Cyclooxygenaseaktivität im bovinen Ovidukt beiträgt. Zur Lokalisierung ausgewählter Proteine innerhalb des Ovidukts wurden immunhistologische Färbungen für COX-1, COX-2 und mPGES-1 durchgeführt. COX-1 und mPGES-1 wurden sowohl in Epithelzellen als auch glatten Muskelzellen des Ovidukts exprimiert, COX-2 wurde ausschließlich in den Epithelzellen gefunden. Während COX-1 innerhalb der Epithelzellen sowohl in Zytoplasma als auch Kern angefärbt war, wurde für mPGES-1 nur eine Kernfärbung gefunden. COX-2 war ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert. In den glatten Muskelzellen wurden COX-1 und mPGES-1 im Zytoplasma detektiert. Um eine potentielle Regulation der mRNA Expression dieser Enzyme zu erkennen, wurden kultivierte bovine Oviduktzellen mit Östradiol, Progesteron, Arachidonsäure oder PGE2 über einen Zeitraum von 6 Stunden behandelt. Dabei wurde festgestellt, dass die mRNA Expression von cPLA2α, COX-2 und mPGES-1 durch alle Behandlungen stimuliert wurde. Die mRNA Expression von PGIS wurde nur durch die Zugabe von PGE2 stimuliert. Die anderen Enzyme zeigten keine Veränderung ihrer mRNA Expression durch die Behandlung mit Östradiol, Progesteron, Arachidonsäure oder PGE2. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit lässt sich folgern, dass im bovinen Ovidukt ein feinabgestimmtes und zyklusabhängig reguliertes Prostaglandinsynthesesystem existiert. Das lässt vermuten, dass Prostaglandine im bovinen Ovidukt direkten Einfluss nehmen könnten auf das Überleben, die Reifung und den Transport der Oozyte sowie auf den Befruchtungsvorgang und die Entwicklung des Embryos. Es ist folglich anzunehmen, dass die Prostaglandine, wie in anderen Tierarten bereits gezeigt, auch im Genitaltrakt der Kuh eine essentielle Rolle bei der Entstehung eines neuen Organismus spielen.

The oviduct plays a decisive role in reproduction as it provides a beneficial environment for oocyte maturation, capacitation, gamete transport, fertilization, and the early embryonic development. The latter are key processes in the origin of pregnancy which are regulated by hormones, e.g. sexual steroids and prostaglandins. For instance, prostaglandins are considered to be central mediators concerning ovulation, fertilization, as well as establishment and maintenance of pregnancy. Several prostaglandins were already detected in the bovine oviduct. To get a better insight into the regulation of prostaglandin synthesis within the bovine oviduct, estrous cycle-dependent changes and local distributions of the enzymes were examined on mRNA and partly on the protein level. Bovine oviducts were collected at the local slaughterhouse and classified into one of the following four phases: pre- (days 19-21) and postovulatory phase (days 1-5), early luteal phase (days 6-12), and late luteal phase (days 13-18). Moreover, the oviducts of each cow were separated into the ipsilateral (to ovulation site/corpus luteum) and the contralateral oviduct and further divided into ampulla and isthmus. The mRNA expression of sPLA2, cPLA2α, cPLA2β, COX-1, COX-2, cPGES, mPGES-1, mPGES-2, PGFS, HSD, H-PGDS, L-PGDS and PGIS was investigated in flushed oviductal cells by quantitative RT-PCR. Specific mRNA transcripts of the listed enzymes were detected in the bovine oviduct. COX-1, mPGES-1, HSD, PGFS and H-PGDS were significantly higher expressed during the post-ovulatory phase at the time of early reproductive events. The highest expression of cPLA2β and PGIS was detected in the pre-ovulatory phase while L-PGDS showed the highest expression in the late luteal phase. In contrast, sPLA2, cPLA2α, COX-2, cPGES and mPGES-2 were expressed estrous cycle-independently. Concerning the different regions in the oviduct, sPLA2, L-PGDS and PGIS were higher expressed in the ampullary parts in contrast to mPGES-1 and HSD which showed a higher expression in the isthmic parts. No differences were observed between ipsi- and contralateral oviducts. The protein amount of cyclooxygenases was quantified via western blot analysis in relation to the estrous cycle-phase and the region of the oviduct. COX-1 showed the highest protein expression in the early luteal phase compared with the other phases. COX-2 showed a constant expression without an evident regulation during estrous cycle. The examination of cyclooxygenase activity revealed, that COX-1 contributed the majority of the cyclooxygenase activity within the bovine oviduct. Immunohistological stainings for COX-1, COX-2 and mPGES-1 revealed their exact localization within the oviduct. COX-1 and mPGES-1 were located in epithelial and smooth muscle cells in contrast to COX-2 which was exclusively localized in epithelial cells. Inside epithelial cells, mPGES-1 showed a nuclear staining while COX-1 was found in the cytoplasm and nucleus. COX-2 was exclusively located in the cytoplasm. In the smooth muscle cells COX-1 and mPGES-1 showed a cytoplasmic staining. Additionally, a potential regulation of the mRNA expression of these enzymes was investigated in cultured primary oviductal cells after treatment with 17β- estradiol, progesterone, arachidonic acid or PGE2 in a time-dependent experiment over a period of 6 hours. Cell culture experiments revealed that cPLA2α, COX-2 and mPGES-1 mRNA expression was stimulated by all treatments while PGIS mRNA was higher expressed after PGE2 application. The other enzymes did not show any changes in their mRNA expression after treatment with 17β- estradiol, progesterone, arachidonic acid or PGE2. All the results of this study support the hypothesis that a fine-tuned and estrous cycle-dependent regulated system for prostaglandin synthethis exists in the bovine oviduct. That suggests that prostaglandins may directly influence survival, maturation and transport of the oocyte as well as fertilization and embryonic development. Therefore, it is likely that prostaglandins play an essential role in the genital tract of the cow concerning the origin of a new organism.