Entwicklung eines Zellkultur-basierten Testverfahrens zur Evaluierung potentieller Wirkstoffe gegen Cryptosporidium parvum

Abstract

Cryptosporidiose ist eine sowohl bei Menschen als auch bei Tieren weltweit auftretende gastrointestinale Infektion, die durch das zoonotische Protozoon C. parvum und weitere Vertreter derselben Gattung verursacht wird. Der klinische Verlauf einer durch C. parvum induzierten Darminfektion ist eng mit dem Immunstatus des Wirtes assoziiert. Bei immunkompetenten Personen tritt als Folge einer Infektion mit diesem Erreger in der Regel eine akute, selbstlimitierende Durchfallerkrankung auf, die sich im Gegensatz dazu bei immundefizienten Personen zu einer chronischen und lebensbedrohlichen Erkrankungen mit unter Umständen (zusätzlichen) extraintestinalen Manifestationen entwickeln kann. Aber nicht nur in der Humanmedizin, sondern auch in der Veterinärmedizin zählt C. parvum zu den relevantesten parasitären Enteritiserregern. Durch ihr noch unausgereiftes Immunsystem sind in besonderem Maße Neonaten für eine Infektion mit diesem Erreger empfänglich und infizieren sich regelmäßig durch eine orale Aufnahme der übiquitär vorkommenden und gegenüber Umwelteinflüssen und Chemikalien sehr resistenten Dauerstadien (Oocysten). Als einer der Hauptverursacher der neonatalen Diarrhoe beim Kalb ist C. parvum verantwortlich für Verluste in der Kälberaufzucht, ein mit einem retardierten Wachstum einhergehendes vermindertes Schlachtgewicht und folglich Verursacher von erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in der Landwirtschaft. Sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin existieren zugelassene Wirkstoffe zur Behandlung bzw. Pro- und Metaphylaxe einer humanen bzw. bovinen Cryptosporidiose. Leider erweist sich deren Einsatz nicht in allen Fällen einer Cryptosporidiose als effektiv, so dass uneingeschränkt wirksame Chemotherapeutika bis heute nicht verfügbar sind, aber dringend benötigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode zur Evaluierung einer anticryptosporidialen Wirksamkeit potentieller bis dato noch nicht überprüfter Wirkstoffe etabliert. Bei dem als „C. parvum Inhibitionsassay“ bezeichneten Testverfahren handelt es sich um eine Kombination aus einer in vitro Kultivierung von C. parvum in HCT-8 Zellen und einer quantitativen real-time PCR (qPCR). Die qPCR ermöglichte eine relative Quantifizierung der Erregerentwicklung unter Wirkstoffeinfluss, so dass eine Aussage zu einer potentiell anticryptosporidialen Wirksamkeit der untersuchten Substanzen getroffen werden konnte. Als Zielsequenz fungierte hierbei ein 255 bp umfassender Abschnitt der cryptosporidialen 18S rDNA, dessen Gehalt in jeder einzelnen Probe anhand einer internen Kontrolle normiert wurde. Als interne Kontrolle wurde eine 189 bp umfassende Sequenz innerhalb des zellulären (humanen) 18S rDNA Gens verwendet, deren Gehalt in den einzelnen Proben anhand einer zweiten qPCR ermittelt wurde. Insgesamt wurden 51 Wirkstoffe in mindestens drei verschiedenen Konzentrationen überprüft. Zwei vielversprechend erscheinende Wirkstoffe, ein heterozyklisch substituiertes 1,2,4-Triazin (BAY-AB24992) und ein substituiertes Benzimidazol (BAY-AF76184), wurden eingehender untersucht. Ihr mittels des C. parvum Inhibitionsassays überprüftes Konzentrationsspektrum umfasste insgesamt acht Verdünnungsstufen und selbige Konzentrationen wurden ebenfalls mittels eines Lactatdehydrogenase (LDH)-Assays und eines WST-1-Assays auf zytotoxische und zytostatische Effekte auf die gewählte Wirtszelllinie untersucht. Für die Substanz BAY-AF76184 konnte eine gute konzentrationsabhängige Wirksamkeit gegen C. parvum mit Inhibitionen des cryptosporidialen Wachstums im Größenbereich von maximal 97 % gezeigt werden. Der ermittelte EC50-Wert belief sich auf 2,37 μM. Obgleich für diesen Wirkstoff auch konzentrationsabhängige antiproliferative und zytotoxische Effekte auf die HCT-8 Zelllinie nachgewiesen werden konnten, ist eine weitere Überprüfung in niedrigen Dosierungen in Tiermodellen angeraten. Selbst sehr niedrige Wirkstoffkonzentrationen in Höhe von 4,46 μM, die nicht mehr mit zytostatischen Effekten und einer nur sehr geringen Zytotoxizität assoziiert waren, erzielten in vitro noch Wachstumsinhibitionen von C. parvum im Größenbereich von ca. 78 %, weshalb diese Substanz trotz seiner unerwünschten Eigenschaften durchaus als vielsprechend gelten kann. Auch für BAY-AB24992 scheint eine nachfolgende in vivo Überprüfung empfehlenswert. Zwar war für diese Substanz keine Konzentrationsabhängigkeit nachweisbar und in vitro bewirkten nur die vier höchsten Konzentrationen eine über 60%ige Wachstumsinhibition von C. parvum (ca. 71 bis 88 %), allerdings konnten für diesen Wirkstoff keinerlei antiproliferative Effekte und auch nur eine sehr geringe Zytotoxizität nachgewiesen werden. Insgesamt betrachtet stellt das hier etablierte C. parvum Inhibitionsassay eine Methode dar, die eine schnelle und zuverlässige parallele Überprüfung mehrerer Substanzen auf ihre Wirksamkeit gegen das Protozoon C. parvum ermöglicht. Es ist folglich dazu geeignet, ethisch bedenkliche, kostenintensive und arbeitsaufwendige Tierversuche zumindest partiell zu ersetzten. Obgleich von einer attestierten Wirksamkeit in vitro nicht zwangsläufig auf eine Wirksamkeit in vivo geschlossen werden kann, so eignet sich ein Zellkultur-basiertes Testverfahren dennoch zur Vorselektion solcher Wirkstoffe, die in nachgeschalteten Tierversuchen mit einer größeren Wahrscheinlichkeit positive Ergebnisse erzielen könnten.

Cryptosporidiosis is a common gastro-intestinal infection in both, humans and animals, worldwide caused by the zoonotic protozoan C. parvum and other members of the same genus. The clinical course of C. parvum infections is highly dependent on the immune status of the individual host. While in immunocompetent individuals Cryptosporidium infections most commonly result in acute but self-limiting gastroenteritis, in immunodeficient or immunosupressed individuals cryptosporidiosis can become a chronic and life-threatening diarrhoeal disease and also (additional) extraintestinal infections may occur. Not only in human medicine but also in veterinary medicine C. parvum ranges among the most relevant parasitic enteritis pathogens. Due to their immature immune system neonates are highly susceptible for infections with this parasite and routinely get infected by oral uptake of the ubiquitary oocysts which are very resistant against environmental changes and chemicals. As one of the major pathogens causing neonatal diarrhoea in calves, C. parvum is responsible for fatalities and retarded weight gain in calf rearing and therefore the cause of significant economical losses in agriculture. Even though approved agents for the treatment of cryptosporidiosis and for pro- and metaphylactic use are available in human as well as in veterinary medicine, fully effective drugs in all cases of cryptosporidiosis are still missing but urgently needed. In the present work a method was established to evaluate the efficacy of putative anticryptosporidial compounds which had not been tested yet. The so-called ”C. parvum inhibition assay“ is a combination of in vitro cultivation of C. parvum in HCT-8 cells and quantitative real-time PCR (qPCR). The qPCR-based method used here allowed the relative quantification of the development of C. parvum under drug exposure, therefore the efficacy of the tested compound could be determined. For the detection of the parasite DNA a target sequence of 255 bp within the cryptosporidial 18S rDNA gene was used. The amount of this target sequence was normalised to an internal control for each sample. As internal control a sequence with a size of 189 bp from the human host cell 18S rDNA gene was amplified in a second qPCR. Overall 51 compounds were tested in at least three different concentrations. Two promising compounds, a heterocyclic substituted 1,2,4-triazinedione (BAY- AB24992) and a substituted benzimidazole (BAY-AF76184), were examined in more detail. Both compounds were tested in eight different concentrations for their ability to interfere with C. parvum development in vitro. Furthermore the same concentrations were also used in a lactate dehydrogenase and a WST-1 assay to analyse potential cytotoxic and anti-proliferative effects on the chosen host cell line, respectively. The drug BAY-AF76184 displayed a good concentration- dependent inhibition of C. parvum growth with a maximum inhibition of 97%. The concentration response curve had an EC50 value of 2.37 μM. Although this compound also showed concentration-dependent antiproliferative and cytotoxic effects on HCT-8 cells, further in vivo tests at low dosages are advisable. Even a concentration of 4.46 μM, which was associated with low cytotoxicity and no cytostatic effect, reached an inhibition of the growth of C. parvum in vitro of approximately 78%. Therefore BAY-AF76184 can be considered a promising/putative compound despite its unwanted side effects. Future in vivo testing of BAY-AB24992 also appears to be recommendable. This compound did not inhibit C. parvum growth in a concentration-dependant manner but also showed good in vitro efficacy against C. parvum. At least the four highest concentrations yielded an inhibition of more than 60% (approx. 71-88%). Additionally this drug had neither antiproliferative nor cytotoxic effects. Overall the established C. parvum inhibition assay displays a fast and reliable method for assessing drug efficacy against the protozoan C. parvum. Consequently it is suitable to at least partially replace expensive and labour-intensive animal experiments which are also of ethical concern. Although there is of course no guarantee that drugs with good in vitro activity will also perform in vivo, a cell culture-based assay nevertheless improves prediction for overall success of consecutive in vivo tests.