Technology Development for Oligonucleotide Fingerprinting: applying multiplexed PNA hybridizations and MALDI-TOF mass spectrometry detection

Abstract

Oligonucleotide fingerprinting (OFP) represents a powerful means of cDNA and genomic DNA library characterization and normalization. As a result of OFP and its high degree of normalization non-redundant "unigene" sets are created for an organism or specific tissue thereof. These embody highly valuable resources for subsequent downstream applications and hence represent an important step towards a functional interpretation of the obtained sequence data. Nevertheless, current technological limitations, such as the high number of oligonucleotide probes required and the restriction to serial hybridizations, impede a higher throughput and thus further boost of OFP as an efficient tool for DNA characterization. The objective of this dissertation was to overcome these limitations and create an innovative technological foundation for OFP. By applying multiplexed peptide nucleic acid (PNA) hybridizations and matrix- assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI- TOF MS) as a means of hybridization detection it was aimed at developing the procedure to a high degree of multiplexing. Within the scope of the dissertation, several characteristics of PNA hybridizations and subsequent analysis by MALDI-TOF MS were investigated that led to new insight. It could be demonstrated that by the use of PNA oligonucleotides hybridization probe length can be reduced to hexamers providing the basis for a significant reduction of the overall number of hybridization probes needed for an OFP analysis. Besides, owing to positive charge-tagging of PNA an unparalleled degree of multiplexing could be accomplished. A simultaneous hybridization of 21 different PNA oligonucleotides was shown to be feasible. Furthermore, in an extensive pilot study carried out on selected genomic DNA and cDNA clones, the applicability of the multiplexed OFP concept was successfully demonstrated. Moreover, several substrates and DNA attachment chemistries were evaluated with respect to their suitability as MALDI-TOF MS compatible DNA immobilization systems of which nylon membrane-based and polyamidoamine (PAMAM) dendrimer-based systems possess great potential. By a further optimization of PNA hybridization probe sets and complete automation of the entire procedure, multiplexed OFP is expected to be established as routine application with a significantly enhanced throughput.

Oligonukleotid-Fingerprinting (OFP) ist eine sehr leistungsfähige Methode der Charakterisierung und Normalisierung von sowohl cDNA Bibliotheken als auch genomischen Bibliotheken. Mittels des durch OFP zu erreichenden hohen Normalisierungsgrades können nicht redundante "unigene" Sets für einen Organismus bzw. ein bestimmtes Gewebe erzeugt werden. Diese sind nicht nur eine sehr wertvolle Ressource für weiterführende experimentelle Anwendungen, sondern stellen auch einen wichtigen Schritt in Richtung funktioneller Sequenzanalyse dar. Bestehende technologische Limitierungen, wie z.B. die benötigte große Anzahl an Oligonukleotid-Sonden und die Beschränkung auf serielle Hybridisierungen, verhindern jedoch einen höheren Durchsatz und somit breiteren Einsatz von OFP als Werkzeug zur DNA Charakterisierung. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war die Überwindung dieser Limitierungen sowie die Schaffung eines innovativen technologischen Fundaments für OFP. Durch die Anwendung von multiplex Peptid-Nukleinsäure (PNA) Hybridisierungen und Matrix- unterstützter Laserdesorption/Ionisierung-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI- TOF MS) als Detektionsmittel sollte die Methode zu einem Verfahren mit hohem Grad an Multiplexing entwickelt werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurden mehrere Charakteristika von PNA Hybridisierungen mit anschließender MALDI-TOF MS Analyse untersucht, die zu neuen Erkenntnissen führten. So konnte gezeigt werden, daß durch die Verwendung von PNA Oligonukleotiden die Länge der Hybridisierungssonden reduziert werden kann und Hexamere als Sonden eingesetzt werden können. Dadurch ist es möglich, die Gesamtmenge an für ein OFP Projekt benötigten Hybridisierungssonden erheblich zu senken. Ferner konnte aufgezeigt werden, daß aufgrund positiven "charge taggings" von PNA ein beispielloser Grad an Multiplexing erreichbar ist. 21 unterschiedliche PNA Oligonukleotide wurden gleichzeitig hybridisiert und erfolgreich detektiert. Darüber hinaus konnte in einer extensiven Pilotstudie an ausgewählten cDNA Klonen und genomischen Klonen die Machbarkeit des multiplex OFP Konzepts bewiesen werden. Des Weiteren wurden mehrere potentielle Substrate und DNA Anbindungsstrategien hinsichtlich ihrer Eignung als Bestandteil eines MALDI-TOF MS kompatiblen DNA Immobilisierungssystem evaluiert, von denen die auf Nylonmembran und Polyamidoamin-Dendrimeren basierenden Systeme ein vielversprechendes Potential besitzen. Durch eine weitere Optimierung der Erstellung von PNA Hybridisierungssonden-Sets sowie eine vollständige Automatisierung des gesamtes Verfahrens wird erwartet, daß multiplex OFP als Routineanwendung mit einem im Vergleich erheblich erhöhten Durchsatz etabliert werden kann.