Effekt von Makrophagen-Subpopulationen auf die intestinale Barriere

Abstract

Einleitung. Makrophagen sind von entscheidender Bedeutung in der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (CED). Sie werden in ein Spektrum eingeteilt, das von pro- bis hin zu anti-inflammatorischen Makrophagen reicht. Neben dem inflammatorischen Zellinfiltrat der Lamina propria stellt die Störung der epithelialen Barriere einen weiteren zentralen Pathomechanismus der CED-Entstehung dar. Ziel dieser Arbeit war es, den spezifischen Effekt von Makrophagen-Subpopulationen auf die epitheliale Barriere zu untersuchen. Methodik. Durch Immunhistochemie an intestinalen Resektionspräparaten wurde das Vorkommen von Makrophagen-Subpopulationen in der Mukosa des entzündeten Darms bei Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa quantifiziert und mit gesunden Kontrollen verglichen. Humane CD14+ Zellen des peripheren Bluts wurden in vitro in pro- bzw. anti-inflammatorische Makrophagen polarisiert und der Einfluss dieser Subtypen sowie von Monozyten als Kontrollpopulation auf verschiedene Epithelzelllinien (Caco-2, T84, HT-29/B6) mittels Widerstandsmessungen analysiert. Die Epithelzellen wurden anschließend durch Immunfluoreszenzfärbungen weiter charakterisiert. Zytokinkonzentrationen im Überstand wurden mittels „cytometric bead array“ und enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantifiziert. Eine Inhibition von Tumor Nekrose Faktor (TNF), Interleukin (IL)-1β und IL 18 wurde durch Verwendung spezifischer Antikörper bzw. Rezeptor-Antagonisten erreicht. Ergebnisse. Sowohl bei Patienten mit Morbus Crohn als auch mit Colitis ulcerosa fand sich eine massive Invasion der pro-inflammatorischen CD68+/iNOS+/TNF+-Makrophagen in die Lamina propria des entzündeten Darms. So verschob sich die Balance der Makrophagen in Richtung des pro-inflammatorischen Subtyps, wobei dieser Effekt beim Morbus Crohn am stärksten ausgeprägt war. In-vitro polarisierte pro-inflammatorische Makrophagen führten zu einem Widerstandsverlust und somit zu einer Störung der epithelialen Integrität von Caco-2, T84 und HT29/B6 Zellen, was durch Stimulation von Toll-like-Rezeptoren mit Lipopolysaccharid nochmals verstärkt wurde. Mechanistisch ist dies durch parazelluläre Leckage mittels deregulierter tight junction-Proteine zu erklären: Vor allem das porenbildende Claudin-2 wurde nach Co-Kultur mit den pro-inflammatorischen Makrophagen vermehrt an der Epithelzellmembran exprimiert. Ferner kam es zu einer Umverteilung von tight junction-Proteinen innerhalb der Zelle. Die pro-inflammatorischen Makrophagen waren charakterisiert durch eine hohe Expression von TNF. Daher konnte der vermittelte Epithelschaden effektiv durch die Inhibition von TNF durch Infliximab reduziert werden. Der Monozyten-induzierte Epithelschaden hingegen ließ sich durch IL-1-Rezeptor- Inhibition bzw. einen spezifischen Antikörper gegen IL-18 effektiv antagonisieren. Schlussfolgerung. Pro-inflammatorische Makrophagen, die die Lamina propria von CED-Patienten infiltrieren, beeinträchtigen die epitheliale Barriere durch Deregulation von Tight Junction-Proteinen. Durch Zytokin-Blockade kann dies effektiv antagonisiert werden, wodurch einer Chronifizierung der Entzündung entgegengewirkt werden kann.

Background. Macrophages are key players in inflammatory bowel disease (IBD). They can be classified into pro- and anti-inflammatory macrophages. Besides inflammatory cell infiltrates in the lamina propria of the gut, intestinal barrier dysfunction is a main feature of the pathogenesis of IBD. Hence, the aim of this study was to determine the specific effect of macrophage subtypes on epithelial barrier. Methods. The presence of macrophage subtypes in intestinal resection specimens of IBD patients was visualized by immunohistochemistry and compared to healthy controls. Human peripheral blood CD14+ cells were polarized into either pro- or anti-inflammatory macrophages in vitro. The influence of these subtypes and monocytes as control population on epithelial cell layers (Caco-2, T84, HT-29/B6) was analyzed using resistance measurements. Epithelial cells were then further examined by immunofluorescence staining. Cytokine concentrations were quantified applying cytometric bead array and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Inhibition of TNF, IL-1β and IL-18 was achieved by specific antibodies or receptor antagonists. Results. A massive invasion of pro-inflammatory CD68+/iNOS+/TNF+ macrophages into the lamina propria of the inflamed intestine occurred in IBD patients, predominantly in Crohn´s disease, thereby shifting the balance of macrophages to a pro-inflammatory state. In-vitro polarized pro-inflammatory macrophages caused a significant loss of epithelial resistance and thus integrity of Caco-2, T84 and HT29/B6 cell layers. This was further amplified by toll-like receptor stimulation via addition of LPS. The mechanism was paracellular leakage through deregulation and/or redistribution of tight junction proteins, most notably claudin-2, caused by monocytes and pro-inflammatory macrophages. Pro-inflammatory macrophages were characterized by a dominant production of TNF. Consequently, the epithelial damage mediated by this cell population was effectively reduced via inhibition of TNF through infliximab. Monocyte-mediated damage was antagonized by inhibition of the inflammasome effector cytokines IL-1β and IL-18. Conclusion. Pro-inflammatory macrophages, as found in the lamina propria of IBD patients, disrupt the epithelial barrier through deregulation of tight junction proteins. This can effectively be antagonized by cytokine inhibition.