Entwicklung einer bimodalen Sonde für die MRT- und Fluoreszenzbildgebung auf Basis Europium-dotierter Eisenoxid-Nanopartikel

Abstract

Motivation: Die Verbesserung des histologischen und analytischen Nachweises von Magnetresonanz (MR)-aktiven superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (SPIOs) und deren eindeutige Differenzierung vom physiologischen Eisenhintergrund für die biomedizinische Forschung.

Zielsetzung: Es wurde die Einsetzbarkeit von mit Europium- (Eu3+-) Ionen dotierten SPIOs als bimodale Sonde für die MR-Bildgebung, für die histologische Detektion mittels Fluoreszenzmikroskopie sowie für die quantitative Analytik mittels Spektrophotometrie untersucht. Hierfür wurde eine spezielle Variante von SPIOs, sehr kleine superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (VSOPs), verwendet.

Methodik: VSOPs, elektrostatisch stabilisiert über eine Citratbeschichtung, wurden synthetisiert, einerseits mit und andererseits ohne Eu3+-Dotierung (Eu-VSOPs bzw. VSOPs). Eu-VSOPs und VSOPs wurden charakterisiert und ihre physikochemischen Eigenschaften miteinander verglichen. Eine sowohl für die Analytik als auch für die Histologie anwendbare Antennenlösung wurde entwickelt, welche die Fluoreszenz der Eu3+-Ionen in den Eu-VSOPs verstärkt. Eu-VSOPs wurden am Zellmodell RAW264.7 histologisch mittels Fluoreszenzmikroskopie sowie auch analytisch mittels Fluoreszenz-Spektrophotometrie untersucht. Die Ergebnisse aus diesen beiden Nachweismethoden wurden mit denen aus den jeweiligen klassischen Methoden für Eisennachweise verglichen: Die histologische Berliner-Blau-Färbung bzw. die analytische Bestimmung des Eisengehalts mit der Phenanthrolin-Methode über Photometrie.

Ergebnisse: Eu-VSOPs unterscheiden sich von VSOPs nicht in ihren Eigenschaften hinsichtlich ihrer hydrodynamischen Größe, ihrer Kerndurchmesser sowie ihren Signalverstärkungseffekten in der MR-Bildgebung. Es wurde eine Antennenlösung entwickelt, welche bei einem pH-Wert von 6,6 und damit nahe des physiologischen Bereichs puffert und dabei sowohl eine große Pufferkapazität als auch eine große Stabilität gegenüber Eisenionen aufweist. Mittels dieser Antennenlösung wurde der genaue Anteil der Eu3+-Ionen in den Eu-VSOPs spektrophotometrisch bestimmt. Als Anwendung am Zellmodell konnte nachgewiesen werden, dass die Fluoreszenzmikroskopie Eu-VSOPs mit einer höheren Empfindlichkeit nachweisen kann als die Lichtmikroskopie in Kombination mit der Berliner Blau-Färbung. Sowohl in der Mikroskopie als auch in der analytischen Quantifizierung der Eu-VSOPs mittels Fluoreszenzdetektion wird der Partikelnachweis nicht durch einen eventuell vorhandenen Eisenhintergrund verfälscht.

Schlussfolgerungen: Die Dotierung von VSOPs mit Eu3+-Ionen bietet in Kombination mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Antennenlösung die Möglichkeit, sowohl qualitative wie quantitative, eindeutige Aussagen hinsichtlich Pharmakokinetik und Biodistribution der Eisenoxid-Nanopartikel auf zellulärer Ebene treffen zu können.

Background: There is a need to improve the histological and analytical detection limits for magnetic resonance (MR) active superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIOs), and to develop a method to unambiguously differentiate them from the background physiological iron, for biomedical research.

Objective: The applicability of SPIOs with europium (Eu3+) dotation as a bimodal tool for MR imaging, and histological detection via fluorescence microscopy, as well as for quantitative analytics using spectrophotometry was investigated. For this, very small superparamagnetic iron oxide nanoparticles (VSOPs), a variant of SPIOs, were used.

Methods: VSOPs were electrostatically stabilized by means of a citrate coating. In addition to standard VSOPs, particles were also synthesized with Eu3+ dotation (Eu-VSOPs), and the physicochemical properties of both particles were compared. An antenna solution was developed to enhance the fluorescence of the Eu3+ ions in the Eu-VSOPs. The applicability of the antenna solution for analytics and for histology was determined. Eu-VSOPs were investigated in RAW264.7 cells histologically via fluorescence microscopy and analytically by means of fluorescence spectrophotometry. The results of these two fluorescent detection methods were compared with detection by standard methods for iron detection: the histological Prussian Blue staining and the analytical determination of the concentration of iron-phenanthroline complexes via photometry.

Results: No difference between Eu-VSOPs and VSOPs was detected in terms of hydrodynamic size, core diameter and signal enhancing effects in MR imaging. An antenna solution buffering with a great capacity near the physiological pH (6.6) was developed. The fluorescence enhancing effect of the antenna solution was highly stable in the presence of iron ions. By means of the antenna solution, the exact proportion of Eu3+ ions in the Eu-VSOPs was determined spectrophotometrically. In the cell model, the detection of Eu-VSOPs with the antenna solution was more sensitive than with light microscopy and Prussian Blue staining. For microscopy as well as for analytical quantification of Eu-VSOPs, the detection of the particles via fluorescence methods allows to differentiate the particles from eventually existing background iron.

Conclusions: Eu3+ doped VSOPs in combination with the antenna solution developed here provide an effective tool for unambiguous qualitative and quantitative investigation of the pharmacokinetics and biodistribution of iron oxide nanoparticles at the cellular level.