Chemosensation and belowground host plant finding in Melolontha melolontha L. larvae

Abstract

Larvae of the common cockchafer (M. melolontha L.) are important agricultural pests in Europe, due to their feeding activities on roots of different crops and fruit trees. However, the most preferred host plant of the larvae is the ruderal plant dandelion (Taraxacum sect. ruderalia). As also known for other soil-dwelling insects, M. melolontha larvae are able to use plant root emitted carbon dioxide (CO2) to locate their host plants belowground. However, this gas is ubiquitous in soil and thus delivers relatively unspecific information to root herbivores like M. melolontha. The presence of olfactory and gustatory sensory organs (sensilla) indicates the importance of these senses for the orientation of the respective insect. The morphology of sensilla usually allows their assignment to functions. Although a multitude of studies that provide microscopic images and descriptions of sensilla on soil-dwelling insects is published to date, detailed information, which would allow the determination of functions of the sensilla, is scarce. Due to the difficulties involved in chemical analysis of substances and observation of organisms in soil, little knowledge is available on the emission and perception of chemical information that is exchanged between plant roots and soil-dwelling insects. Previous studies mostly applied simplified models, which, due to their constitution and uniformity, differ from the conditions present in the natural environment of plants and their root herbivores. Thus, elementary questions regarding the sensory equipment of soil inhabiting insects, belowground availability of chemical stimuli, and host location remained unanswered, not only for cockchafer larvae. In this dissertation, an inventory of the sensory equipment of antennae, maxillary and labial palps of M. melolontha larvae was established by means of electron microscopy (chapter 2). The chemosensory function of head appendages was examined by electrophysiology. In a multitude of behavioral assays, the impact of various plant treatments (symbiotic relationship to arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), plant age, light intensity and substrate type) on larval host location to dandelion roots was investigated (chapter 3). By means of solid phase extraction of volatile and non-volatile compounds and analysis with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), the impact of abovementioned conditions on the composition of potential infochemicals in the rhizosphere of dandelion was determined (chapter 4). Furthermore, electrophysiological and behavioral experiments were applied to reveal, if and which root-derived substances are detected by antennae and palps of the larvae (chapter 2) and if these substances induce behavioral responses (chapter 5). The results of this dissertation show that M. melolontha larvae possess a complex chemosensory system. The multitude of olfactory and gustatory sensilla on antennae and palps enable the larvae to detect substances of many different compound classes (aldehydes, alcohols, amines, esters, ketones, organic acids, terpenoids, sugars), of which most are released by plant roots. Olfactory pore plates are the largest sensilla on the antennae. They detect a multitude of odorants released by plant roots, and they are probably also responsible for the detection of CO2. Further chemosensory sensilla are present in great number on both palps. The distribution of sensilla may be adapted to contact with the surrounding substrate, which allows the use of non-volatile root-derived compounds but also increases the abrasion of sensilla. The latter effect may explain an increased functional redundancy of sensilla: most sensilla are present on more than one head appendage and most odorants are also detected on more than one head appendage. M. melolontha larvae are able to discriminate between differentially treated plants of the same species. Changes in biotic (AMF, plant age) and abiotic (light intensity, substrate type) growth conditions alter the attractiveness of dandelion roots to the larvae. Certain combinations of these factors may even render the usually preferred host plant unattractive or untraceable to the larvae. These observations are not predictable by the measured concentrations of root emitted CO2. Thus, the data suggest that further root-derived substances are required for larval host location. These substances may be attractive or repellent per se or mask the attractiveness of CO2. Abovementioned plant growth conditions also accounted for specific patterns of volatile (e.g. sesquiterpenes) and non-volatile (e.g. sugars) root-derived components, measured in rhizospheres of undamaged dandelion. Several root-derived aldehydes, ketones, organic acids, terpenoids and sugars are behaviorally active and may function as chemical cues for the larvae. Out of the 32 volatile compounds tested, (+)-camphene, a-pinene, acetone, and 1-hexanol attract the larvae, whereas propionic acid, g-terpinene and benzaldehyde are repellent. Furthermore, the larvae follow gradients of sucrose to its source, whereas mannose is avoided. In contrast to the prevalent assumption that M. melolontha larvae would exclusively orient in CO2 – gradients, the findings presented here show that further infochemicals from various compound classes are perceived and alter the larval behavior. The chemosensory equipment of larvae was found to be surprisingly complex and is the basis for the distinct preferences of the polyphagous root herbivore. In summary, the presented results indicate that the development of targeted agricultural measures, which may have a potential to distract cockchafer larvae from most valuable crops, is possible. However, the application of the groundwork presented here requires an expansion of research by additionally including soil microbiota other than mycorrhizal fungi, including further abiotic variables such as phosphorous and nitrogen supply of the plant, and finally testing a variety of host and non-host plants under field conditions in choice assays.

Larven des Feldmaikäfers (Melolontha melolontha L.) sind durch ihren Fraß an Wurzeln verschiedener Feldfrüchte und Obstbäume wichtige landwirtschaftliche Schädlinge in Europa. Die von den Larven am meisten präferierte Wirtspflanze ist allerdings die Ruderalpflanze Löwenzahn (Taraxacum sect. ruderalia). Wie auch von anderen bodenlebenden Insekten bekannt ist, können M. melolontha Larven von Wurzeln produziertes Kohlendioxyd (CO2) nutzen, um ihre Wirtspflanzen unterirdisch zu orten. Allerdings ist dieses Gas allgegenwärtig im Boden und liefert Wurzelherbivoren wie M. melolontha relativ unspezifische Informationen. Die Anwesenheit von Geruchs- und Geschmackssinnesorganen, den sogenannten Sensillen, indiziert die Relevanz dieser Sinne für die Orientierung des Insekts. Aus der Morphologie der Sensillen lässt sich zumeist deren Funktion ableiten. Obschon eine Vielzahl an Studien publiziert ist, die mikroskopische Aufnahmen und Beschreibungen von Sensillen bodenlebender Insekten beinhalten, fehlen zumeist Detailinformationen, die Schlüsse auf deren Funktion zulassen. Aufgrund der Schwierigkeiten, die mit chemischer Analytik von Substanzen und Beobachtung von Organismen im Boden einhergehen, ist bislang wenig bekannt über Abgabe und Wahrnehmung chemischer Informationen, die zwischen Pflanzenwurzeln und bodenlebenden Insekten ausgetauscht werden. In vielen vorangegangenen Studien wurden zumeist stark vereinfachte Modelle verwendet, die in ihrer Art und Einheitlichkeit von den in der Natur von Pflanzen und assoziierten Wurzelherbivoren vorherrschenden Bedingungen abweichen. Somit waren grundlegende Fragen hinsichtlich der sensorischen Ausstattung bodenbewohnender Insekten, der Verfügbarkeit chemischer Stimuli sowie der Wirtpflanzenortung und -wahl nicht nur für Maikäferlarven unbeantwortet. Im Rahmen dieser Dissertation wurde mittels elektronenmikroskopischer Methoden eine Bestandsaufnahme der sensorischen Ausstattung der Antennen, Maxillarpalpen und Labialpalpen von M. melolontha Larven gefertigt (Kapitel 2). Die chemo-sensorische Funktion der Kopfanhänge wurde elektrophysiologisch untersucht. In einer Vielzahl von durchgeführten Verhaltenstests wurde die Wirkung verschiedener Behandlungen (symbiotische Beziehung zu arbuskulären Mycorrhizapilzen (arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), Alter der Pflanzen, Lichtintensität und Art des Substrats) auf die Wirtsfindung der Larven zu Löwenzahnwurzeln untersucht (Kapitel 3). Mit Hilfe von wässriger Extraktion und Festphasenextraktion von flüchtigen und nicht- flüchtigen Verbindungen mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) wurde bestimmt, welche Auswirkungen die genannten Bedingungen auf die Zusammensetzung potentieller Infochemikalien in der Rhizosphere von Löwenzahn haben (Kapitel 4). Mittels elektrophysiologischer Untersuchungen und Verhaltenstests wurde zudem untersucht, ob und welche wurzelbürtigen Substanzen von den Antennen und Palpen der Engerlinge detektiert werden können (Kapitel 2) und ob diese Stoffe Verhaltensantworten auslösen (Kapitel 5). Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen, dass M. melolontha Larven über ein komplexes chemo-sensorisches System verfügen. Mit der Vielzahl an olfaktorischen und gustatorischen Sensillen auf den Antennen und Palpen detektieren Engerlinge Substanzen verschiedenster Stoffklassen (Aldehyde, Alkohole, Amine, Ester, Ketone, organische Säuren, Terpenoide, Zucker), von denen die meisten bekanntermaßen von Pflanzenwurzeln abgegeben werden. Olfaktorische Porenplatten sind die flächenmäßig umfangreichsten Sensillen der Antennen. Sie detektieren eine Vielzahl an Duftstoffen, die von Pflanzenwurzeln abgegeben werden und dienen mit hoher Wahrscheinlichkeit auch der Wahrnehmung von CO2. Weitere chemo-sensorische Sensillen der Larven sind in großer Zahl auf den Palpen ansässig. Diese Verteilung der Sensillen könnte mit dem umgebenden Substrat zusammenhängen, welches zum einen die Nutzung nicht-flüchtiger wurzelbürtiger Verbindungen ermöglicht, zum anderen jedoch auch die Abnutzung der Sensillen erhöht. Letzteres könnte der Grund für die hohe funktionelle Redundanz der Sensillen sein: Die meisten Sensillentypen befinden sich auf mehr als einem der Kopfanhänge und die meisten Duftstoffe werden ebenfalls an mehreren der Kopfanhänge detektiert. M. melolontha Larven sind in der Lage, innerhalb einer Pflanzenart zwischen Pflanzen unterschiedlicher Behandlung zu unterscheiden. Änderungen der biotischen (AMF, Pflanzenalter) und abiotischen (Lichtintensität und Substratbeschaffenheit) Wachstumsbedingungen verändern die Attraktivität der Löwenzahnwurzeln für die Larven. Bei bestimmten Kombinationen dieser Bedingungen können die normalerweise stark präferierten Löwenzahnwurzeln unattraktiv bzw. für die Larven nicht auffindbar sein. Diese Beobachtungen lassen sich nicht anhand der gemessenen Konzentrationen des von der Wurzel abgegebenen CO2 erklären. Somit deuten diese Befunde darauf hin, dass weitere wurzelbürtige Substanzen für die Wirtsfindung der Larven benötigt werden. Entsprechende Substanzen könnten an sich attraktiv oder abstoßend wirken, oder die Attraktivität des CO2 für die Larven maskieren. Es wurden für die oben genannten Anzuchtbedingungen spezifische Muster flüchtiger Verbindungen wie Sesquiterpene und wasserlöslicher Verbindungen wie Zucker über unverletzte Löwenzahnwurzeln gemessen. Einige Aldehyde, Alkohole, Ketone, organische Säuren, Terpenoide und Zucker aus Wurzelexudaten sind verhaltensaktiv und könnten von den Larven als Botenstoffe zur Wirtsfindung im Boden verwendet werden. Von den 32 getesteten flüchtigen Verbindungen sind (+)-Camphen, a-Pinen, Aceton und 1-Hexanol attraktiv, wohingegen Propionsäure, g-Terpinen und Benzaldehyd abstoßend auf die Larven wirken. Darüber hinaus bewegen sich die Larven in einem Gradienten aus Saccharose zur Quelle, wohingegen Mannose gemieden wird. Entgegen der bislang weitverbreitenden Annahme, M. melolontha Larven orientierten sich ausschließlich anhand von CO2-Gradienten, konnte hier gezeigt werden, dass weitere Infochemikalien aus zahlreichen Stoffklassen wahrgenommen werden und das Verhalten modifizieren. Die chemo-sensorische Ausstattung der Larven hat sich als überraschend komplex erwiesen und ist die Grundlage für eingehende Präferenzen dieses polyphagen Wurzelherbivoren. Die Befunde lassen die Entwicklung von landwirtschaftlich anwendbaren Techniken möglich erscheinen, mit deren Hilfe Engerlinge von den wertvollsten Kulturpflanzen fern gehalten werden könnten. Um die hier präsentierten Grundlagen der Anwendung zugänglich zu machen, ist allerdings weitere Forschung erforderlich, die weitere bodenlebende Mikroorganismen neben Mykorrhizapilzen und weitere abiotische Bedingungen, wie beispielsweise Phosphat- und Stickstoffversorgung der Pflanzen und schließlich verschiedene Wirts- und Nicht-Wirtspflanzen unter Feldbedingungen in Verhaltenstests einbeziehen sollte.