Development of a molecular toolbox to study the cross-talk between Angiotensin II type 1 and Endothelin-1 type A receptors in the context of obliterative vasculopathy

Abstract

Background: Autoantibodies simultaneously targeting two G protein-coupled receptors, Angiotensin II type 1 (AT1R) and Endothelin-1 type A receptor (ETAR), induce severe obliterative vasculopathy observed in graft rejection and systemic sclerosis. A molecular toolbox was generated to study the cross- talk between AT1R and ETAR in the context of obliterative vasculopathy. Methods: HEK cell lines over-expressing stably the tagged receptors individually or dually were generated by transfection and appropriate antibiotics selection. The clones over-expressing the tagged receptors were selected and verified by western blot and immunoprecipitation. IgG were isolated from patients with obliterative vasculopathy by HiTrap Protein G columns, and F(ab)2 fragments without Fc were generated by pepsin digestion. A GPCR activation assay was elaborated by expressing isolated human GPCRs in genetically modified yeasts. Results: HEK cell lines over-expressing stably individually and dually tagged AT1R and ETAR were successfully generated. The over-expressed receptors triggered ERK phosphorylation both in endogenous and immune context. To verify the role of autoantibodies in the receptors immune- mediated activation, F(ab)2 fragments without Fc were generated. In the dual stable cell, F(ab)2 fragments were significantly biologically active (p<0.05). The stable cell lines were used to study the interaction between the AT1 and ETA receptors. After having verified that antibodies directed against the tagged receptors specifically immunoprecipitated them, co-immunoprecipitation experiments were performed. The results suggest that the receptors could interact. As the second extracellular loop of the receptors could be involved in their immune activation, ECL2 of AT1R and ETAR were mutated. A GPCR activation assay was elaborated to assess the activation of isolated human receptors. The results showed that endogenous and immune-mediated activation of the receptors depend on the ECL2 in AT1R but not in ETAR. Conclusion: A molecular toolbox based on stable human cell lines and a yeast GPCR activation assay has been elaborated. It was used to gain knowledge on the cross-talk between the Angiotensin II type 1 and the Endothelin-1 type A receptors. The results suggest that AT1R and ETAR might form constitutive heterodimers. Besides, IgG digestion brought convincing evidence that antibodies against AT1R and ETAR play an important role in transducing intracellular signals. The results also confirmed that the second extracellular loop is a conformation- sensitive site for natural ligand and autoantibodies in AT1R but not in ETAR. This molecular toolbox is thus of great advantage in understanding the pathogenesis of immune-mediated obliterative vasculopathy and discovering new therapeutic strategies.

Hintergrund: Autoantikörper, die gleichzeitig gegen zwei G-Protein gekoppelte Rezeptoren, den Angiotensin II Typ 1 Rezeptor (AT1R) und Endothelin-1 Typ A Rezeptor (ETAR) gerichtet sind, sind Auslöser schwerer obliterativer Vaskulopathien, wie Sie bei Transplantatabstossung und Systemischer Sklerose beobachtet werden. Es wurden molekulare Modelle generiert, die ein Studium des Crosstalks zwischen AT1R und ETAR in diesem klinischen Kontext ermöglichen. Methoden: Durch Transfektion und entsprechende Antibiotikaselektion wurden HEK Zelllinien generiert, die individuell oder dual getaggte Rezeptoren stabil exprimierten. Die getaggte Rezeptoren überexprimierenden Klone wurden selektiert und durch Westernblots und Immun-präzipitationen verifiziert. Mittels HiTrap Protein G Säulen wurde IgG von Patienten mit obliterativer Vaskulpathie isoliert und F(ab)2 Fragmente ohne Fc durch Pepsinverdau generiert. Zur Testung der GPCR Aktivierung wurde ein Assay ausgearbeitet mit genetisch veränderte Hefen, die isolierte humane GPCR exprimieren. Ergebnisse: HEK-Zelllinien, die stabil individuell oder dual getaggte Rezeptoren AT1R und ETAR exprimieren wurden erfolgreich generiert. Die überexprimierenden Rezeptoren triggerten ERK Phosphorylierung sowohl im endogenen, als auch immunen Kontext. Zur Verifizierung der Rolle der Autoantikörper in der immun- vermittelten Aktivierung, wurden F(ab)2 Fragmente ohne Fc generiert. In der dual stabilen Zelllinie, waren die F(ab)2 Fragmente signifikant biologisch aktiv (p<0.05). Die stabilen Zelllinien wurden zur Untersuchung der Interaktion zwischen dem AT1R und ETAR verwendet. Mit den gegen die getaggten Rezeptoren gerichteten Antikörper wurden Koimmunpräzipitationen durchgeführt. Die Ergebnisse wiesen auf eine Interaktion zwischen den beiden Rezeptoren hin. Da der zweite extrazelluläre Loop der Rezeptoren bei ihrer Immunaktivierung beteiligt sein könnte, wurden der ECL2 des AT1R und ETAR mutiert. Zur Testung der GPCR Aktivierung wurde ein Assay zur Aktivitätsbestimmung isolierter humaner GPCR ausgearbeitet. Damit konnte gezeigt werden, dass endogene und immunvermittelte Aktivierung der Rezeptoren durch den ECL2 nur beim AT1R, nicht jedoch beim ETAR bestimmt wird. Schlussfolgerung: In der vorliegenden Arbeit wurden molekulare Werkzeuge mit stabilen humanen Zelllinien und ein GPCR-Aktivitätsassay in einem Hefemodell erstellt. Diese wurden benutzt, um Kenntnisse über den Crosstalk zwischen Angiotensin II Typ 1 und Endothelin-1 Typ A Rezeptor zu erzielen. Die Ergebnisse legen es nahe, dass AT1R und ETAR konstitutive Heterodimere ausbilden könnten. Darüberhinaus zeigte IgG Verdau auf, dass Antikörper gegen AT1R und ETAR eine wichtige Rolle in der Vermittlung intrazellulärer Signale spielen. Die Ergebnisse bestätigten auch, dass der zweite extrazelluläre Loop eine konformationssensitive Stelle für den natürlichen Liganden und Autoantikörper bei AT1R, nicht jedoch ETAR darstellt. Diese molekularen Werkzeuge sind daher ein großer Gewinn, die Pathogenese immunvermittelter obliterativer Vaskulopathien zu verstehen und neue therapeutische Strategien aufzudecken.