Entwicklung einer gattungsspezifischen PCR für Mykobakterien mit speziesspezifischer Detektion durch Restriktions-Endonukleasen Anhand des 16S- 23S rDNA Gen Spacers

Abstract

In dieser Arbeit wurde eine genusspezifische PCR für Mykobakterien entwickelt und zusätzlich eine einfache Identifikation durch Restriktions Fragment Längen Polymorphismus (RFLP) bis zum Spezieslevel erreicht anhand des 16S – 23S rDNA Spacers. Es ist gelungen, mit der Auswahl der Primer, die Gattung Mykobakterien nach PCR und damit vor Restriktion , sicher von anderen nicht mykobakteriellen Spezies abzugrenzen und damit eine Genusspezifität zu erlangen. Es wurden insgesamt 811 Bakterienstämme untersucht, davon 678 mykobakterielle Stämme. Alle mykobakteriellen Stämme wurden von den neuen Primern amplifiziert. Von den nicht mykobakteriellen isolaten wurde nur Gordona terrae amplifiziert. Das ausgedachte RFLP Schema beinhaltet PCR Produkte in unterschiedlichen Größen swie die Restriktionsanalyse durch HaeIII und CfoI ( Endonukleasen). Es brachte 58 HaeIII Muster hervor, davon waren 49 ( 84%) einzigartig auf Speziesebene. Daher war der HaeIII Verdau zusammen mit den CfoI Ergebnissen ausrichend für eine korrekte Indentifizierung von 39 von 54 mykobakteriellen Taxone. Ein klar angelegter Algrhitmus veranschaulichte, dass sich die nachgebliebenen nicht identifizierten Spezies in fünf Cluster von nahe verwandten Spezies aufteilten. Diese wurden erfolgreich durch weitere Enzyme (TaqI, MspI, DdeI oder AvaII) separiert. Neben den langsamwachsenden Mykobakterien wurden so auch alle untersuchten schnellwachsenden Mykobakterien ( z.B. M. abcessus, M. chelonae, M. farcinogenes, M. fortuitum, M. peregrinum, und M. senegalense/sehr hohe 16S rDNA Sequenzsimilarität) korrekt identifieziert. Durch die hohe Intraspezies Sequenzstabilität und durch die Tatsache, dass die einzelnen Muster gut voneinander zu unterscheiden sind, eignet sich diese Methodefür schnelle und kosteneffektive Identifikation eines weiten Spektrums an Spezies ohne sequenzieren zu müssen. Aus phylogenetischem Gesichtspunkt, stimmen die Spacersequenzdaten gut mit den 16S rDNA Ergebnissen überein. Das wurde auch durch die Stämme mit nicht klassifizierter Taxonomie gezeigt. Da die Methode dieser Arbeit sowohl signifikante subspezifische Genotypen als auch ein weites Spektrum an mykobakteriellen Spezies durch die Identifikation von einem spezifischen Muster innerhalb einer Spezies erkannte, eignet sie sich nicht nur für Forschungszwecke, sondern kann auch in Routinelaboratorien angewandt werden.

A novel genus-specific PCR for mycobacteria with simple identification to the species level by restriction fragment length polymorphism was established using the 16S-23S – rDNA spacer as a target. Panspecifity of primers was demonstrated on the genus level by testing 811 bacterial strains, of which were 678 mycobacterial strains. All mycobacterial isolates were amplified by the new primers. Among the nonmycobacterial isolates, only gordona terrae was amplified by the new primers. The RFLP sheme devised involves etimation of variable PCR product sizes together with HaeIII and CfoI restriction analysis. It yielded 58 HaeIII patterns, of which 49 (84%) were unique to the species level. Hence, HaeIII digestion together with CfoI results was sufficient for correct identification of 39 of 54 mycobacterial taxons. Following a clearly laid ot diagnostic algrithm, the remaining unidentified organisms fell into 5 clusters of closely related species, that were sucessfully separated using additional enzymes ( TaqI, MspI, DdeI or AvaII). Thus, next to slowly growing mycobacteria, all rapidly growing species studied, including M. abcessus, M. chelonae, M. farcinogenes, M. fortuitum, M. peregrinum, and M. senegalense ( with a very high 16S rDNA sequence similarity) were correctly identified. A high intraspecies sequence stability and the good dicriminative power of patterns indicate that this method is very suitable for rapid and cost- effective identification of a wide variety of mycobacterial species without the need for sequencing. Phylogenetically, spacer sequence data stand in good agreement with 16S rDNA sequencing results, as was shown by including strains with unsettled taxonomy. Sinc this approach recognized significant subspecific genotypes while identification of a broad spectrum of mycobacteria rested on identification of one specific RFLP pattern within a species, this method can be used by both reference (or research) and routine laboratories.