Tailor-made antioxidative nanocrystals: production and in vitro efficacy

Abstract

High pressure homogenization was applied to produce apigenin, hesperetin, quercetin and rutin nanocrystals. The factors influencing the final particle size were investigated in order to find an efficient method to control the particle size. The final sizes ranged from 197 nm to 517 nm. It was implied that the physicochemical properties of actives could influence the size. Higher intensity of inputted energy, more cycles of high pressure homogenization, lower active concentration could facilitate the formation of smaller nanocrystals. The summarized “Limitation theory” indicates that every factor has its limitation in devoting to the diminution. For efficiently decreasing particle size, factors that do not meet their limitations should be modified. Quercetin nanocrystals with various sizes were produced and the size influence on the neuroprotective effect on human neuroblastoma cells SH-SY5Y in presence of endogenous neurotoxins salolinol, 6-hydroxydopamine and 3-hydroxykynurenine was investigated. Via controlling the production conditions, different sizes were achieved. Compared with the quercetin DMSO solution, quercetin nanocrystals showed less toxicity. Interestingly, quercetin nanocrystals showed toxicity in the researched concentration. Furthermore, smaller size presented higher toxicity. The main reason might be the prooxidative effect of quercetin. However, it was also proven that to make active into nanocrystals could enhance the absorption due to the increased solubility and the potential endocytosis. Not only the concentration affects the performance of quercetin, but the size of the quercetin particle also affects. Rutin nanocrystals were prepared by a simple combinational method involving an ultra-high speed rotor/stator dispersion system and the high pressure homogenization. This method with ultra-high speed R/S dispersion followed by low energy HPH can be successfully applied to the production of rutin nanocrystals. Nanocrystals produced in high energy HPH achieved a size of 381 nm after twenty cycles at 1500 bar. However, with optimized formulation in low energy HPH, only 4 min pre-treatment with ultra-high speed rotor/stator dispersion system and one cycle at 300 bar, 606 nm rutin nanocrystals were yielded. Further 10 cycles HPH at 500 bar produced nanocrystals with 479 nm. The surfactants combination of Tween® 80 and Plantacare 2000® UP was proven more reliable to stabilize the researched system. The product from optimized formulation held a considerable long-term stability. Compared with the traditional high pressure homogenization, bead milling, or the combinational technology of bead milling and high pressure homogenization, this method presents as a simpler and more convenient production method and can be easily adopted in industrial scale. Hesperidin nanocrystals was produced by smartCrystals technology on large scale (18 kg scale 18% concentrate by WBM then 18 kg scale 5% dilution by HPH). With more passages proceeded by wet bead milling, the size of hesperidin nanocrystals became smaller down to 290 nm. After dilution one cycle at 500 bar, the size achieved 260 nm. High reproducibility was observed by the PCS diameters within ± 10 nm and LD size with less fluctuation. The content of hesperidin and preservative were both stable in three dilution batches as well. The established process is reliable in produce hesperidin nanocrystals and suitable for industrial production. Now it is used for production of the cosmetic nanocrystal concentrate smartCrystal-lemon extract. AOCs of hesperidin, quercetin and rutin nanocrystals were measured using the KRL Test, which is unlike traditional chemical method but applied cells’ viability as the indicator of the AOC. The comparisons between nanocrystals of each API, each API and the corresponding bulk powder as well as the comparison between the nanocrystals with different sizes were performed. Rutin has the highest AOC compared to the others. The nanocrystals of each API have higher AOC than the bulk powder. The smaller size presents higher AOC, which certifies the advantages of the nanocrystals in antioxidative effect.

Apigenin, Hesperetin, Quercetin und Rutin Nanokristalle wurden mittels Hochdruckhomogenisation hergestellt. Um eine effiziente Methode zur Steuerung der Partikelgröße zu ermitteln, wurden Faktoren untersucht, welche die endgültige Partikelgröße beeinflussen. Die finalen Größen reichen von 197 nm bis 517 nm. Es wurde impliziert, dass die physikochemischen Eigenschaften der Wirkstoffe die Größe beeinflussen können. Höhere Intensitäten der eingesetzten Energie, mehrere Hochdruckhomogenisationszyklen, sowie geringere Wirkstoffkonzentration können die Bildung kleinerer Nanokristalle erleichtern. Die zusammengefasste „Grenztheorie“ besagt, dass jeder Faktor seine eigene Limitierung im Hinblick auf die Partikelreduzierung besitzt. Für eine effiziente Verringerung sollten nur Faktoren, welche ihre Grenze nicht erreicht haben, modifiziert werden. Im Anschluss wurden Quercetin Nanokristalle verschiedener Größen produziert und der Einfluss der Partikelgröße auf den neuroprotektiven Effekt menschlicher Neuroblastom-Zellen SH-SY5Y in Gegenwart von endogenen Neurotoxinen wie Salolinol, 6-Hydroxydopamin und 3-Hydroxykynurenin untersucht. Mittels Kontrolle der Produktionsbedingungen konnten verschiedene Größen erzielt werden. Verglichen mit der Quercetin-DMSO-Lösung, wiesen die Quercetin Nanokristalle eine geringere Toxizität auf. Allerdings zeigten sich toxische Effekte der Quercetin Nanokristalle in der untersuchten Konzentration. Weiterhin verwiesen kleinere Partikelgrößen auf eine höhere Toxizität. Der Hauptgrund könnte der prooxidative Effekt von Quercetin sein. Jedoch hat sich ebenfalls bewährt, dass die Zugabe von Wirkstoffkomponenten in Nanokristalle die Absorption durch gesteigerte Löslichkeit und gesteigerter Endozytose verbessern können. Nicht nur die Konzentration wirkte sich somit auf die Leistung von Quercetin aus, sondern auch ihre Partikelgrößen. Rutin Nanokristalle wurden durch eine einfache Kombinationsmethode hergestellt, welche ein Ultra- Hochgeschwindigkeits-Rotor/Stator-Dispersionssystem und Hochdruckhomogenisation (HDH) umfassten. Diese Methode mit Ultra- Hochgeschwindigkeits-R/S-Dispersion gefolgt von HDH mit geringer Energie, konnte sehr erfolgreich in der Produktion von Rutin Nanokristallen angewendet werden. Nanokristalle, welche mit hoher Energie in HDH produziert wurden, erreichten nach 20 Zyklen und 1500 bar eine Größe von 381 nm. Allerdings ergaben sich aus der optimierten Formulierung aus HDH mit niedriger Energie und nur 4 Minuten Vorbehandlung mittels Ultra-Hochgeschwindigkeits-Rotor /Stator-Dispersion System sowie einem Zyklus bei 300 bar, 606 nm große Rutin Nanokristalle. Weitere 10 Zyklen HDH bei 500 bar produzierten Nanokristalle mit 479 nm. Es wurde nachgewiesen, dass die Tensidkombination aus Tween® 80 und Plantacare® 2000 UP das untersuchte System zuverlässig stabilisierten. Das Produkt der optimierten Formulierung besaß eine erhebliche Langzeitstabilität. Verglichen mit der traditionellen Hochdruckhomogenisation, Perlmahlung oder der Kombinationstechnologie aus beiden Verfahren, repräsentiert diese Methode die einfachste und bequemste Produktion und kann folglich leicht in den industriellen Maßstab übernommen werden. Hesperidin Nanokristalle wurden mittels „smartCrystals“ Technologie im großen Maßstab produziert (18 kg Charge mit 18% Konzentrat mittels Nass-Perlmahlung mit anschließender Verdünnung von 18 kg Charge auf 5% mittels HDH). Nach mehreren Durchgängen der Nass- Perlmahlung, nimmt die Größe der Hesperidin Nanokristalle weiter bis auf 290 nm ab. Nach Verdünnung und Durchführung eines Zyklus bei 500 bar, erreichte die Partikelgröße 260 nm. Hohe Reproduzierbarkeit konnte anhand des PCS Durchmesser mit einer Schwankung um ±10 nm und einer geringen Abweichung der LD Größe festgestellt werden. Die Gehalte von Hesperidin und dem Konservierungsmittel waren in allen 3 produzierten Chargen stabil. Der etablierte Prozess ist zuverlässig im Produzieren von Hesperidin Nanokristallen und geeignet für die industrielle Produktion. Derzeit wird es für die Herstellung von kosmetischem Nanokristall-Konzentrat in smartCrystal- Zitonenextrakt genutzt. Antioxidative Kapazitäten (AOK) von Hesperidin, Quercetin und Rutin Nanokristallen wurden mittels KRL-Test gemessen, welche im Gegensatz zur herkömmlichen chemischen Methode, die Zelllebensfähigkeit als Indikator für die AOK verwendet. Vergleiche zwischen Nanokristallen jedes einzelnen Wirkstoffes und des dazugehörigen Grobpulvers sowie die Gegenüberstellung von Nanokristallen verschiedener Größen wurden durchgeführt. Rutin besaß die höchste AOK im Vergleich zu allen anderen Wirkstoffen. Die Nanokristalle von jedem Wirkstoff hatten höhere AOKs als das dazugehörige Grobpulver. Kleinere Partikelgrößen wiesen höhere AOKs auf, welche die Vorteile von Nanokristallen im Hinblick auf antioxidative Effekte bescheinigen.