Biochemische und funktionelle Untersuchungen zur Signaltransduktion des Zell- Zell-Adhäsionsmoleküls CEACAM1 exprimiert auf endothelialen Zellen

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschreibt in in vitro-Studien biochemische und funktionelle Eigenschaften der CEACAM1-Signaltransduktionsmechanismen. Hierzu wurden endotheliale Zellen isoliert, charakterisiert und für funktionelle Studien mit CEACAM1-Isoformen transfiziert. Es konnte eine stimulierende Wirkung von CEACAM1 auf die Netzwerk-Formation von Endothelzellen beobachtet werden. Ferner konnte eine erhöhte Zellmigration von CEACAM1-positiven gegenüber CEACAM1-negativen Zellen gemessen werden. Matrixprotein-abhängig beeinflusste die CEACAM1-Expression das Spreiten von Zellen. CEACAM1-positive RBE-Zellen zeigten eine veränderte Zellmorphologie, die durch eine andersartige Organisation des Aktinzytoskeletts verursacht wurde. CEACAM1-transfizierte Zellen zeigten lange Zellfortsätze mit ausgeprägten Lamaellipodien und eine stark verringerte Stressfaserformation. Diese Veränderungen wa-ren sensitiv gegenüber Rho-Aktivierung bzw. deutlicher ausgeprägt nach Inhibition der Rho-Effektorkinase ROCK. Weiterhin konnte ein "Cross-talk" zu Integrinen bzw. Integrin-vermittelten Signalwegen während der Zell-Matrix-Adhäsion dargestellt werden: CEACAM1-positive Endothelzellen zeigten eine reduzierte Tyrosinphosphorylierung der Fokalen Adhäsionskinase (FAK) und eine verringerte Anzahl gereifter, Paxillin-positiver fokaler Komplexe auf Laminin-1. Während der Zell-Matrix-Adhäsion assoziiert CEACAM1-long mit dem Aktinzytoskelett. Matrixprotein-abhängig konnte eine Interaktion von CEACAM1-Molekülen mit Talin, einem Regulator der Integrinfunktion, dargestellt werden. Durch Detergenz-Unlöslichkeitsstudien sowie isopyknische Dichtegradientenzentrifugation wurde eine Assoziation von CEACAM1 und Membranmikrodomänen aufgezeigt. Diese Assoziation ließ sich durch CHAPS oder Detergenzien der Brij-Serie, nicht aber mit Triton X-100 darstellen. Cholesterin-Depletion zeigte, dass die CEACAM1-positiven Mikrodomänen, wie klassische "lipid rafts", auf Cholesterin basieren. CEACAM1-Isoformen lokalisierten unabhängig von der Länge ihrer zytoplasmatischen Domäne an endothelialen Zellkontakten. Zelldichte-abhängig wird CEACAM1-long während der Formation von Zellkontakten transient an Tyrosinresten phosphoryliert. Durch Verwendung von Tyrosinkinase-Inhibitoren konnte gezeigt werden, dass diese Phosphorylierung von der Aktivität der Kinasen der src-Familie abhängig war. Tyrosin-phosphoryliertes CEACAM1-long interagiert an Zellkontakten mit der Protein-Tyrosin-Phosphatase SHP-2. Cholesterin-Depletion der Plasmamembran konfluenter Zellen führte zu einer Reduktion der detektierbaren CEACAM1-long-Tyrosinphosphorylierung und einer Verminderung der kopräzipitierbaren Menge SHP-2. Proliferationsstudien mit CEACAM1-positiven bzw. negativen RBE-Zellen offenbarten ein unterschiedliches Ansprechverhalten auf TGF-beta-Stimulation. Während TGF-beta die Proliferation von CEACAM1-negativen Zellen kaum hemmte, zeigten sich CEACAM1-Transfektanten stark inhibiert. Zusätzlich zeigte CEACAM1-long nach TGF-beta-Stimulation eine Reduktion der Phosphorylierung am Tyr488. Studien mit SMAD-Proteinen ergaben, dass in CEACAM1-positiven Zellen die Zytosol-Kern-Translokation von SMAD1/5-Proteinen nach TGF-beta-Stimulation gestört ist.

The aim of the present study was to determine the biological functions of transmembrane CEACAM1 isoforms expressed in cultured rat brain endothelial cells. The main focus of the presented data was the analysis of functional and biochemical impact of CEACAM1-mediated signaling during dynamic processes like cell adhesion, cell migration and contact formation of endothelial cells. During in vitro angiogenesis assays, expression of CEACAM1-L promotes network formation of endothelial cells and increased cell motility. During cell-matrix adhesion, CEACAM1-L translocated into the Triton X-100-insoluble cytoskeletal fraction and affected cell spreading and cell morphology on Matrigel and laminin-1 but not on fibronectin. On laminin-1, CEACAM1 expressing cells developed protrusions with lamellipodia and showed less stress fiber formation. CEACAM1-mediated morphological alterations were sensitive to RhoA activation and depended on Rac1 activation. Analyses of integrin-mediated signaling pathways revealed a functional cross talk of CEACAM1 and integrins, which led to reduced FAK tyrosine phosphorylation and decreased the formation of mature focal adhesios on laminin-1. Furthermore, a matrix protein-dependent association of CEACAM1 and talin, an important regulator of integrin function, was detected. Solubilization experiments with endothelial cells overexpressing CEACAM1-isoforms showed a partial insolubility of CEACAM1-L in Triton X-100 lysis buffer, revealing a strong anchorage to the actin cytoskeleton of this isoform. Using CHAPS, CEACAM1 localized in detergent-insoluble complexes. Moreover, CHAPS-insolubility of CEACAM1 was abrogated after cholesterol depletion. An association of CEACAM1 with lipid raft-like membrane microdomains was analysed by equilibrium sucrose density gradient centrifugation. CEACAM1 is located at intercellular contact areas of transfected endothelial cells when the cells reached confluence. CEACAM1-4L undergoes a transient, cell density dependent phosphorylation on tyrosine residues and tyrosine phosphphorylation was strongly reduced by inhibiting src-family tyrosine kinases. Furthermore, cholesterol depletion of cellular membranes impeded tyrosine phosporylation of CEACAM1-L. Finally, immunoprecipitations of tyrosine phosphorylated CEACAM1-L from recently confluent RBE cells brought down a significant amount of PTP-1D/SHP-2 revealing an association of CEACAM1-L and SHP-2 at cell-cell contact areas that was confirmed by confocal microscopy. Proliferation studies with CEACAM1-posive and -negative cells indicated a differential response upon TGF- beta stimulation. While CEACAM1-negative cells displayed only marginal TGF- beta-mediated inhibition of cell proliferation, CEACAM1-expressing cells were strongly inhibited. This inhibitory effect was independent from the existence of the CEACAM1 cytoplasmic domain. Phosphorylation studies upon TGF-beta- stimulation revealed a transient reduction of the phosphorylation level of Tyr488 within the cytoplasmic domain of CEACAM1-L. In addition, CEACAM1 positive cells diplayed a dysfunction in ALK-1-mediated signaling, revealed by a lack of nuclear translocation of SMAD1/5-proteins upon TGF-beta-stimulation.