The CLCA1 Protein in Innate Immunity – A Mucus Barrier Component or Signaling Molecule?

Abstract

The CLCA (chloride channel regulators, calcium-activated) family comprises highlyconserved proteins with broad tissue expression patterns in many species, which have been shown to possess pleiotropic, yet not exactly determined functions, particularly in inflammatory diseases. Specifically CLCA1, which is secreted by mucus-producing cells e.g. of the respiratory and intestinal tract, is differentially expressed in diseases such as cystic fibrosis (mucoviscidosis), asthma, or chronic obstructive pulmonary disease, serving as a potential therapeutic target. Of all organ systems, CLCA1 is most highly expressed and secreted by mucus cells in the colon and has striking similarities in abundance and expression profile compared to the main structural mucin protein of the intestinal mucus barrier, Muc2. Apart from acting as a presumably structural component, CLCA1 may also function as an extracellular structuremodulating protein, i.e. as zinc-dependent metallohydrolase or as a calcium-dependent chloride channel regulator. Hence, CLCA1 as a structure-associated component of the mucus barrier is one of the most substantiated hypothetic functions, which has not been addressed to date. Here, Clca1-deficient and wild type mice were compared clinically and pathologically under unchallenged conditions as well as at early points in time of dextran sodium sulfate challenge and during fulminant colitis. Expression profiles of select mucin and Clca genes in colon tissue and the fecal microbiota composition were analyzed by reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction. The intestinal mucus barrier was comparatively assessed in terms of mucus penetrability, layering, and goblet cell filling by fluorescence-in situ-hybridization. In addition, the barrier integrity was determined by culture analysis of bacterial translocation into sentinel organs. Nonetheless, no differences between the genotypes were detected in naive or during dextran sodium sulfate-challenged conditions in any of the parameters analyzed. Therefore, CLCA1 does not seem to function as a structural component of the intestinal mucus barrier. Since the second most promising function of CLCA1 includes it being a signaling molecule modulating early inflammatory responses on the cytokine level, the dextran sodium sulfate challenge model was also analyzed regarding this specific effect. Despite no decisive effects on the clinical outcome, a distinct CLCA1 modulation of cytokine expression with a specific effect on chemokine (C-X-C motif) ligand 1 and interleukin 17 was observed during colitis. These findings coincide with previous respiratory challenge models, in which certain cytokines, particularly chemokine (C-X-C motif) ligand 1 and interleukin 17, were also differentially expressed between the genotypes, depending, however, on the stimuli used. This differential cytokine regulation in the dextran sodium sulfate colitis model underlines the previously hypothesized role of CLCA1 as a signaling molecule regulating cytokine expression in early innate immune response. Initial experiments regarding the human ortholog had shown a pro-inflammatory cytokine response in macrophages. Due to speciesspecific CLCA1 differences between humans and mice, caution is warranted in translatability and extrapolation of data between the species. Differences of presumable functions have been established in humans and mice, e.g. the induction of mucus cell metaplasia and the modulation of anion conductance. Therefore, murine CLCA1-mediated activation of murine alveolar and bone marrow-derived monocytes differentiated to macrophages (bone marrowderived macrophages) was analyzed. Lipopolysaccharide, the primary ligand of Toll-like receptor 4 and lipoteichoic acid, a Toll-like receptor 2 agonist, served as positive controls. Murine CLCA1 activated murine alveolar macrophages by inducing several early proinflammatory cytokines and chemokines - similar to the recently described activation of human and porcine macrophages by human CLCA1 - but failed to activate the bone marrowderived macrophages. Hence, these results may fully explain all aspects of the phenotype reported in Clca1-deficient mice infected with Staphylococcus aureus via reduced stimulation of alveolar macrophages by the lack of CLCA1, but fail to explain the contrary phenotype reported in Clca1-deficient mice during DSS colitis. Since bone marrow-derived macrophages were not activated by CLCA1 in this study, susceptibility to CLCA1 activation may be restricted to macrophages in mucosal environments where CLCA1 is normally present, such as the airways. Global gene expression analysis of CLCA1-stimulated alveolar macrophages shed new light on possible CLCA1 downstream pathways. The most strongly down-regulated gene in CLCA1-stimulated alveolar macrophages identified was the host-protective and immunomodulatory airway mucus component BPI fold containing family A member 1 (Bpifa1). BPIFA1 shares striking similarities with several functions hypothesized for CLCA1 in signaling, such as acting in immune defense mechanisms and liquid homeostasis in airway mucosal membranes, regulating cytokine gene expression in macrophages. Furthermore, BPIFA1 expression was also immunohistochemically located in mouse airway macrophages for the first time. Additionally, an in vivo Staphylococcus aureus pneumonia mouse model was analyzed regarding BPIFA1 expression, which suggests that CLCA1 may also modify BPIFA1 in airway epithelial cells. This study showed that CLCA1 may modulate early immune function not as a structural component of the mucus barrier, but as a modulator of cytokine expression in airway macrophages. The exact pathway including its putative receptor remains to be elucidated. Additionally, it should be investigated if CLCA1 may act on other effector cells than airway macrophages. The identification of BPIFA1 expression modulated by CLCA1 may be a link to explain complex downstream pathways associated with CLCA1, which remains to be addressed in the future.

Die CLCA (engl. chloride channel regulators, calcium-activated) Familie besteht aus hochkonservierten Proteinen mit einem breiten, Spezies-übergreifenden Gewebsexpressionsmuster, welche pleiotrope aber bislang nicht näher definierte Funktionen vor allem in inflammatorischen Erkrankungen besitzen. Speziell CLCA1, welches von Mukusproduzierenden Zellen, beispielsweise des Respirations- oder Intestinaltraktes, sezerniert wird, ist in Mukus-assoziierten, respiratorischen Erkrankungen wie zystischer Fibrose (Mukoviszidose), Asthma oder chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (engl. Chronic Obstructive Pulmonary Disease) differenziell exprimiert und wird als potentielles therapeutisches Ziel diskutiert. Von allen Organsystemen ist CLCA1 am stärksten im Kolon exprimiert und wird von Becherzellen des Kolons sezerniert. Es besitzt hinsichtlich Menge und Expressionsprofil bemerkenswerte Ähnlichkeiten mit dem Hauptmuzin der intestinalen Mukusbarriere, Muc2. Abgesehen von seiner Funktion als ausschließlich strukturelle Komponente könnte CLCA1 auch als ein extrazelluläres, die Mukusstruktur modulierendes Protein agieren, beispielsweise als Zink-abhängige Metallohydrolase oder als Kalzium-abhängiger Chloridkanal-Regulator. Eine der belastbarsten hypothetischen Funktionen von CLCA1 ist demnach die einer Struktur-assoziierten Komponente der Mukusbarriere, welche jedoch bislang nicht untersucht wurde. Clca1-defiziente und Wildtyp-Mäuse wurden daher unter naiven Bedingungen als auch unter einer Dextran Natrium Sulfat-induzierten Kolitis zu verschiedenen Zeitpunkten hinsichtlich klinischer und pathologischer Parameter vergleichend untersucht. Expressionsprofile spezifischer Muzin- und Clca-Gene im Kolongewebe, als auch die fäkale Mikrobiota-Zusammensetzung wurden mittels Reverser Transkriptase Polymerase Kettenreaktion bestimmt. Des Weiteren wurde die intestinale Mukusbarriere im Hinblick auf bakterielle Penetrabilität, Mukusschichtung und Becherzellfüllung mittels Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung vergleichend untersucht. Darüber hinaus wurde die Integrität der Mukusbarriere hinsichtlich bakterieller Translokation in Sentinelorgane mittels Kultur analysiert. Es konnten jedoch in sämtlichen untersuchten Parametern keine Unterschiede zwischen den Genotypen unter naiven Bedingungen oder Dextran Natrium Sulfat-induzierter Barrierestörung gefunden werden. Daher spielt CLCA1 als strukturelle Komponente der intestinalen Mukusbarriere keine Rolle. Das vorliegende Modell wurde demnach auch hinsichtlich einer weiteren, vielversprechenden Funktion von CLCA1 - als modulierendes Signalmolekül der Zytokinexpression - analysiert. Obwohl keine Effekte auf klinische Parameter beobachtet wurden, konnte eine deutliche Zytokinexpressionsmodulation durch CLCA1 mit einem spezifischen Effekt auf Chemokin (C-X-C motif) Ligand 1 and Interleukin 17 während der Dextran Natrium Sulfat-Kolitis beobachtet werden. Diese Resultate stimmen mit Ergebnissen respiratorischer Modelle überein, bei denen ebenfalls Chemokin (C-X-C motif) Ligand 1 und Interleukin 17 zwischen den Genotypen differenziell exprimiert waren. Jedoch wurde, abhängig vom eingesetzten Stimulus, eine gegensätzliche Zytokinregulation beobachtet. Diese differenzielle Zytokinregulation im Dextran Natrium Sulfat-Kolitis-Modell unterstreicht die hypothetisierte Rolle von CLCA1 als Signalmolekül der frühen, angeborenen Immunantwort. Initiale Experimente hinsichtlich des humanen orthologen Vertreters hatten eine pro-inflammatorische Zytokinantwort in Makrophagen gezeigt. Aufgrund speziesspezifischer Unterschiede von CLCA1 zwischen Mensch und Maus ist Vorsicht bei der Übertragung und Extrapolation von Daten zwischen den Spezies geboten. Beispielsweise wurden Unterschiede bezüglich der Induktion einer Mukuszellmetaplasie in den Luftwegen und der Modulation einer Anionenleitfähigkeit zwischen Mensch und Maus gefunden. Daher wurde die Aktivierung muriner Alveolarmakrophagen und zu Makrophagen ausdifferenzierter Monozyten des Knochenmarks (Knochenmarksmakrophagen) durch ausschließlich murines CLCA1 in dieser Arbeit analysiert. Lipoploysaccharid, der primäre Ligand des Toll-like Rezeptors 4, und Lipoteichonsäure, ein Toll-like Rezeptor 2 Agonist, dienten als Positivkontrolle. Murines CLCA1 induzierte mehrere proinflammatorische Zytokine und Chemokine in Alveolarmakrophagen, ähnlich der kürzlich beschriebenen Aktivierung humaner und porziner Makrophagen durch seinen humanen Orthologen. Knochenmarksmakrophagen konnten hingegen nicht aktiviert werden. Die Ergebnisse können alle Aspekte des Phänotyps früherer Studien mit Staphylococcus aureus-infizierten, Clca1-defizienten Mäuse über eine durch das Fehlen von CLCA1 reduzierte Alveolarmakrophagenstimulation erklären. Unklar bleibt aber die Zytokinregulation in Clca1-defizienten Mäusen während der Dextran Natrium Sulfat-Kolitis, welche einen gegensätzlichen Verlauf zeigte. Da Knochenmarksmakrophagen nicht durch CLCA1 aktiviert wurden, ist die Empfänglichkeit gegenüber der CLCA1-Aktivierung vermutlich auf Makrophagen mukosaler Kompartimente, in denen CLCA1 normalerweise präsent ist, wie beispielsweise dem Respirationstrakt, begrenzt. Eine globale Genexpressionsanalyse der mit CLCA1 stimulierten Alveolarmakrophagen hat neue Erkenntnisse bezüglich möglicher downstream pathways von CLCA1 erbracht. Das in CLCA1-stimulierten Alveolarmakrophagen am stärksten herunterregulierte Gen war eine protektive und immunomodulatorische Komponente des Mukus des Respirationstraktes, BPI fold containing family A member 1 (Bpifa1). BPIFA1 zeigt bemerkenswerte Ähnlichkeiten zu den für CLCA1 hypothetisierten Funktionen, wie beispielsweise die Funktion in immunologischen Abwehrmechanismen und der Flüssigkeitshomöostase respiratorischer, mukosaler Oberflächen und in der Regulation von Zytokin-Genexpression in Makrophagen. Darüber hinaus wurde die Expression von BPIFA1 in murinen Alveolarmarkophagen erstmals per Immunhistochemie nachgewiesen. Weiterhin konnte die Analyse eines Staphylococcus aureus-Lungenmodells der Maus zeigen, dass CLCA1 die Expression von BPIFA1 auch in respiratorischen Epithelzellen zu modulieren scheint. CLCA1 scheint die frühe Immunantwort nicht als struktureller Bestandteil des Mukus, aber als Modulator der Zytokinexpression von Alveolarmakrophagen zu beeinflussen. Weitere Studien sollten die genauen Aktivierungswege einschließlich möglicher Oberflächenrezeptoren aufschlüsseln und mögliche andere Effektorzellen von CLCA1 identifizieren. Die hier identifizierte Verknüpfung von CLCA1 mit BPIFA1 und ihren Funktionswegen sollte zentraler Punkt der weiteren Forschung sein.