Cowpox virus virulence determinants

Abstract

New cowpox virus (CPXV) infections occur naturally in Germany in increasing numbers. It is striking that an infection of the pet rats with these newly occurring CPXV strains often leads to a lethal outcome. Likewise, a CPXV isolate from a pet rat that as well caused human infection in Southern Germany, RatPox09, causes severe disease in Wistar rats, whereas infection of rats with the well-characterized strain Brighton Red (BR) results only in mild symptoms. Nevertheless, these two strains are highly similar on genomic level: the calculated sequence identity between RatPox09 and BR is 92%. However, with the help of proteome similarity plots, six products with major differences between RatPox09 and BR were identified. Though, minor sequence modifications of unknown impact were found dispersed all over the genome too. The thesis at hand, concentrates on genomic differences between the two CPXV strains, mentioned above. First of all, we analyzed the sequence of the genes of major differences and we generated gain of function mutants with single or multiple genes exchanged. Secondly, for identification of additional virulence factors, we used a novel approach to generate BR-RatPox09 chimeric viruses with approximately 20-40 kbp genome segments exchanged. This was achieved by combining markerless en passant Red recombination and a classical method, homologous recombination in infected vertebrate cells. Since, these CPXV strains of different pathogenic potential in vivo; shows similar growth characteristics in vitro, animal model seems to be the only suitable method to test the virulence of the recombinant viruses. Nevertheless, in vivo models, are not favorable experimental models due to many reasons, including: aspects of animal protection, their long duration and high requirement of labor. In search of a way to reduce the need for animal experiments for testing new recombinant viruses, we evaluated a three-dimensional (3D) skin model as a possible surrogate for animal experiments. We monitored CPXV lesion formation, viral gene expression and cell cycle patterns after infection of 3D skin cultures with RatPox09 and BR. Infected 3D skin cultures exhibited histological alterations that were similar to those of mammal skin infections, but there were no differences in gene expression patterns and tissue damage between the two CPXV strains in the model system. To be brief, 3D skin cultures reflect the development of pox lesions in the human skin, but seem not to allow differentiation between more or less virulent virus strains, a distinction that is made possible by experimental infection in suitable animal models. Therefore, in vivo infection model was applied. CPXV RatPox09 and NMDAr and CrmE mutants, but not segment F chimera, infected rats attained significally higher clinical scores than BAC derived BR or wt BR infected rats (p ≤ 0.05, Anova). However, 6 out of the 8 RatPox09 infected Wistar rats had to be euthanized as their health deteriorated dramatically. Although only 2 out of 10 with BR_RatPox09 NMDAr and 1 out of 10 BR_RatPox09 CrmE infected rats succumbed to the disease. But none of CPXV BR and BR_RatPox09 sF infected rats did. Summing up the results, it can be concluded that, insertion of sequence of putative RatPox09 genes, NMDAr and CrmE, but not the genomic segment F, into strain BR, results in increase of pathogenicity. However, the insertion of these individual ORFs is not sufficient to recreate the pathological effect of RatPox09.

Die Zahl der Kuhpocken Virus Infektionen in Deutschland steigt beständig. Dabei ist auffallend, dass die Infektionen bei als Haustier gehaltenen Ratten mit den neu auftretenden Kuhpocken Stämmen oft einen letalen Verlauf nehmen. Das Kuhpocken Isolat von einer Haustierratte, RatPox09, hat in Süddeutschland auch zu Infektionen beim Menschen geführt. Gleichzeitig verursacht es bei Experimenten ernsthafte Erkrankungen bei Wistar Ratten, wohingegen die Infektion von Ratten mit dem gut charakterisiertem Brighton Red (BR) Stamm, nur zu schwachen Symptomen führt. Dabei ist anzumerken, dass diese beiden Stämme sich genetisch stark ähneln: Die berechneten Übereinstimmungen der Sequenzen von RatPox09 und BR ist 92%. Wie in vorheriger Publikation beschrieben, wurden sechs Genprodukte mit gravierenden Unterschieden zwischen RatPox09 und BR identifiziert. Zusätzlich wurden geringfügige Sequenz Modifikationen, mit unbekannten Wirkungen, über das Genom verteilt gefunden. Diese These konzentriert sich auf die genetischen Unterschiede der beiden Kuhpocken Stämme. Im ersten Schritt wurde die Sequenzen der möglichen Virulenz Faktoren analysiert, dann Brighton Red Einzelgen Knock-in Mutanten konstruiert, die die mögliche Virulenz Faktoren tragen. Im zweiten Schritt, zur Identifizierung zusätzlicher Virulenz Faktoren, wurde ein neuer Ansatz gefunden um BR-RatPox09 Chimäre Viren herzustellen, indem annähernd 20-40 kbp Genome Segmente ausgetauscht wurden. Das wurde mit Hilfe einer zweistufigen Red-Mutagenese erreicht. Zusätzlich wendeten wir noch eine klassische Methode an, die homologe Rekombination in infizierten Vertebraten Zellen. Dadurch, dass diese Kuhpocken Stämme mit sehr unterschiedlichem pathogenem Potential in vivo; welche aber sehr ähnliche Wachstumscharakteristiken in vitro zeigen, scheinen Tiermodelle die einzige angemessene Methode zu sein, die Virulenz der rekombinanten Viren zu testen. Aus unterschiedlichen Gründen sind Tiermodelle nicht zu bevorzugen: einerseits des Tierschutzes wegen, aber auch ihre langen Laufzeiten und der hohe Bedarf an Laborkapazitäten sind ungünstig. Auf der Suche nach einer Methode den Einsatz von Tiermodellen bei den Tests neuer rekombinanter Viren zu reduzieren, haben wir ein dreidimensionales(3D) Hautmodell getestet, als einen möglichen Ersatz für in vivo Versuche. Es waren Kuhpocken Läsionen zu beobachten, wie auch virale Genexpressionen und Muster im Zellzyklus, nach der Infektion von 3D Hautkulturen mit RatPox09 und BR. Infizierte 3D Haut Kulturen zeigten histologische Veränderungen, ähnlich der infizierten Haut von Säugetieren, aber es gab keinen Unterschied in den Genexpressionsmustern und Gewebeschäden zwischen den zwei Kuhpocken Stämmen, in diesem Modellsystem. Kurz gesagt, 3D Hautkulturen spiegeln die Entwicklung der Schädigung durch Pockenviren in der Menschlichen Haut wieder, erlauben aber keine Differenzierung zwischen mehr oder weniger virulenten Stämmen, eine Unterscheidung die durch experimentelle Infektion bei Tiermodellen aber möglich wird. Deswegen wurde die BR Mutanten in einem Infektionsmodell in Wistar Ratten in vivo getestet. Mit Kuhpocken RatPox09, NMDAr und CrmE Mutanten, aber nicht die Segment F Chimära, infizierte Ratten erzielten signifikant höhere klinische Werte als BR infizierte Ratten (p ≤ 0.05, Anova). Dabei ergab sich das 6 von 8 RatPox09 infizierte Wistar Ratten eingeschläfert werden mussten, da ihr gesundheitlicher Zustand sich dramatisch verschlechtertet. Obwohl nur bei 2 von 10 mit BR_RatPox09_NMDAr und bei 1 von 10 mit BR_RatPox09_CrmE infizierten Ratten der Ausbruch der Krankheit zur Einschläferung führte. Zusammengefasst kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass RatPox09 Gene NMDAr und CrmE, aber nicht das genetische Segment F, dazu beisteuern die pathogene Wirkung des CPXV RatPox09 Stamm zu verstärken. Es hat sich aber herausgestellt: Das Insertion dieser individuelle offenere Leserahmen in CPXV BR ist nicht ausreichend, um die pathologische Wirkung von RatPox09 zu erreichen.