Senescence-associated P4-type ATPases in the model plant Arabidopsis thaliana

Abstract

Foliar senescence is an essential aspect within the development of plant leaves. During the past years, scientific research has been focusing on the understanding of the molecular mechanisms underlying senescence. Membrane localized transporters are thought to be necessary items during this highly regulated developmental program. Expression profiling of genes coding for membrane proteins revealed increased transcript amounts of three ALA genes (ALA1, ALA10 and ALA11) during leaf senescence of Arabidopsis thaliana. The genes represent P4-type ATPases that are supposed to translocate aminophospholipids between the two leaflets of biological membranes and, thus, generating asymmetric membranes and inducing vesiculation. In order to characterize ALA1, ALA10 and ALA11, a reverse genetic approach was applied using T-DNA insertional mutants. In this work, the corresponding insertion lines were isolated and identified (ala1, ala10 and ala11) and, to recognize functional redundancy among the ALA members, multiple mutant lines were generated (ala10/11 and ala1/10/11). The mutant lines were phenotypically analyzed regarding their development with a special focus on the nature and progression of senescence. Surprisingly, all investigated mutants displayed premature senescence symptoms at a genetical, physiological and molecular level revealing an important role of the three ALA members for a controlled and unimpaired progression of the senescence process. The premature senescence was accompanied by reduced growth at the plant and cellular level most probably due to deregulated membrane asymmetry. ALA1 localized to plastids and confirming this finding, ala1 displayed an altered plastid morphology lacking grana stacks. It is assumed that the protein is an essential component for proper plastid development. Mutants of ala10 and ala11 displayed abnormal membrane structures within mesophyll cells hinting for an important role of these P4-type ATPases in the maintenance of proper membrane function. Experiments indicated that the proteins might localize to the plasma membrane or the tonoplast, possibly oscillating between the two membrane systems. Lipid analysis indicated that ALA proteins have no specificity for lipids with certain acyl chains. Moreover, the investigations revealed that the proteins play a role in cold tolerance and plant growth via the distribution of lipid- bound fatty acids within cellular membranes. In summary, the investigation of ALA1, ALA10 and ALA11 gave new indications for processes in which P4-type ATPases are involved most probably via regulations of the membrane lipid asymmetry and, thus, contribute to the actual limited knowledge of this protein family in plants.

Die Seneszenz stellt eine wesentliche Entwicklungsphase von pflanzlichen Blättern dar. In den vergangenen Jahren begann sich die wissenschaftliche Forschung auf das Verständnis der molekularen Mechanismen zu konzentrieren, die diesem hoch regulierten Prozess zugrunde liegen. Hierbei wird membranassoziierten Transportern eine besondere Rolle zugeschrieben. Durch die Untersuchung von Genen, die für Transmembranproteine kodieren, stellte sich heraus, dass drei Gene der ALA Familie (ALA1, ALA10 und ALA11) während der Blattseneszenz von Arabidopsis thaliana besonders erhöhte Transkriptmengen aufweisen. Die Gene stellen P4-Typ ATPasen dar, welche vermutlich für die Translokation von Aminophospholipiden innerhalb der beiden Hälften von biologischen Membranen verantwortlich sind und somit asymmetrische Membranen generieren und vesikuläre Prozesse induzieren. Um ALA1, 10 und 11 näher zu charakterisieren, wurde ein revers-genetischer Ansatz basierend auf T-DNA Insertionsmutanten gewählt. In dieser Arbeit wurden die entsprechenden Insertionslinien isoliert, identifiziert (ala1, 10 und 11) und, um funktionelle Redundanzen unter den ALA Mitgliedern aufzuzeigen, Mehrfachmutanten (ala10/11 und ala1/10/11) erzeugt. Die Mutanten wurden bezüglich ihres Phänotyps untersucht, wobei ein besonderes Augenmerk auf die Art und Weise sowie den Verlauf der Seneszenz gelegt wurde. Überraschenderweise zeigten die untersuchten Mutanten eine verfrüht einsetzende Seneszenz, welche auf genetischer, molekularer und physiologischer Ebene nachgewiesen werden konnte. Dies lässt auf eine wichtige Rolle der drei ALA Mitglieder für einen kontrollierten und ungestörten Ablauf der Seneszenz schließen. Die verfrühte Seneszenz der Mutanten wurde von einer Wachstumsreduktion begleitet, welche auch auf zellulärer Ebene zu verzeichnen war und vermutlich durch deregulierte Membranasymmetrie hervorgerufen wird. ALA1 konnte plastidär lokalisiert werden und es liegt nahe, dass das Protein eine essentielle Komponente für eine ungestörte Plastidentwicklung darstellt. Fehlende Granastapel in Plastiden von ala1 Mutanten sowie weitere Störungen in der Plastidmorphologie stützen diesen Befund. ala10 und ala11 Mutanten wiesen abnormale Membranstrukturen in Mesophyllzellen auf, was auf eine wichtige Rolle von P4-Typ ATPasen in der Aufrechterhaltung der normalen Membranfunktion schließen lässt. Die Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Proteine in der Plasmamembran oder im Tonoplasten lokalisieren und möglicherweise zwischen beiden Membransystemen oszillieren. Lipidanalysen ergaben, dass ALA Proteine keine Spezifität für Lipide mit bestimmten Acylketten aufweisen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Proteine in Kältetoleranz und Pflanzenwachstum involviert sind, indem sie die Verteilung von lipidgebundenen Fettsäuren in zellulären Membranen steuern. Zusammenfassend ergaben die Untersuchungen an ALA1, 10 und 11 neue Einsichten in Prozesse, an welchen P4-Typ ATPasen beteiligt sind, was mit großer Wahrscheinlichkeit über die Regulation der Membranlipidasymmetrie erfolgt, wodurch das aktuell verfügbare Wissen über diese Proteinfamilie erweitert werden konnte.