Knockout of A-kinase anchoring protein GSKIP in mice causes perinatal lethality

Abstract

A-kinase anchoring proteins (AKAPs) control the localization of cAMP-dependent protein kinase A (PKA) and tether PKA to distinct cellular compartments. In addition, AKAPs engage in protein-protein interactions with PKA substrates and other signalling proteins and form multi-protein complexes. Thus AKAPs control temporally and spatially the access of PKA to its substrates as well as the crosstalk of PKA with other signalling pathways. Glycogen synthase 3β (GSK3β) interaction protein (GSKIP) was identified as an AKAP by our group. GSKIP directly interacts with PKA and GSK3β and facilitates the inhibitory phosphorylation of GSK3β at Ser9 by PKA in cultured cells. In order to determine the physiological function of GSKIP, in particular its involvement in PKA and GSK3β signalling, a conditional knockout (KO) mouse model had been developed. In this thesis, these GSKIP KO mice were characterized. Downregulation of GSK3β Ser9 phosphorylation upon GSKIP KO was observed in mice early in development in whole embryos, E12.5 primary MEFs and also in later stage E18.5 organs, in line with previous observations in cells and validating the KO mouse model. GSKIP-deficient mice die at birth, presumably because they are unable to initiate breathing properly. GSKIP KO mice at E18.5 appear cyanotic, show a decreased breathing frequency and die within a few minutes. 95 % of E18.5 GSKIP KO mouse lungs do not inflate upon exposure to air. Body and lung weights are unchanged compared to wild type mice. Exposed to respiratory distress at birth, GSKIP-deficient animals possess damaged lung mitochondria and show severely altered metabolite profiles (both in lung and liver) compared to wild type controls, likely accounting for their death. Proteomics revealed the muscle-specific intermediate filament desmin to be at least 50 % downregulated in GSKIP-depleted lungs at E18.5, allowing for a potential connection of mitochondrial aberrations with respiratory failure ultimately causing the perinatal lethality of GSKIP KO mice. The perinatal lethality of conditional GSKIP KO mice at E18.5 points out the essential role of GSKIP for extrauterine life. A 100 % penetrant phenotype in GSKIP KO mice is the incomplete closure of the palatal shelves. Amongst others, GSK3β and Wnt signalling are involved in the developmental stages that lead to the closure. GSKIP depletion delays ossification along the fusion area of secondary palatal bones. These findings indicate a function for GSKIP in the coordination of GSK3β and Wnt signalling in palatal shelf fusion. Large-scale microarrays and validation experiments defined the Gskip-responsive genes Frat2, Rgs1 and Klf2 as downregulated upon GSKIP KO. To circumvent embryonic lethality of the conditional GSKIP KO mice, tissue-specific promoters combined with the Cre/loxP-system were used to generate two adult inducible GSKIP KO mouse models. Since PKA and GSK3β are involved in different physiological processes, amongst others in the control of cardiac myocyte contractility, the depletion of GSKIP in the adult heart and in general in the adult mouse will help to define further molecular pathways involving GSKIP.

A-Kinase-Ankerproteine (AKAP) bilden durch direkte Protein-Protein- Interaktionen mit der cAMP-abhängigen Proteinkinase A (PKA), PKA-Substraten sowie weiteren Signalproteinen Multiproteinkomplexe und verankern diese an spezifischen intrazellulären Kompartimenten. Dadurch kontrollieren AKAP zeitlich und räumlich sowohl den Zugang der PKA zu ihren Substraten, als auch die Integration der PKA in verschiedene Signaltransduktionskaskaden. Glycogen synthase 3β (GSK3β) interaction protein (GSKIP) wurde von unserer Arbeitsgruppe als neues AKAP identifiziert. GSKIP bindet PKA und GSK3β direkt und ermöglicht in kultivierten Zellen die PKA-vermittelte, inhibierende Phosphorylierung der GSK3β. Um die physiologische Bedeutung von GSKIP, insbesondere seine Funktion in PKA- und GSK3β-koordinierten Signalwegen, aufzuklären, war ein konditionelles knockout (KO)-Mausmodell generiert worden. In der vorliegenden Arbeit wurden diese GSKIP-KO-Mäuse charakterisiert. Als Validierung des KO Modells konnte die Abnahme der PKA-abhängigen inhibitorischen GSK3β-Phosphorylierung in Abwesenheit von GSKIP sowohl in frühen Embryonalstadien als auch in primären murinen embryonalen Fibroblasten und in E18.5 Mausgeweben festgestellt und somit zuvor erzielte Ergebnisse aus der Zellkultur in vivo bestätigt werden. GSKIP-defiziente Tiere sterben bei der Geburt, da sie nicht in der Lage sind ihre initial einsetzende Atmung aufrecht zu erhalten. GSKIP-KO-Mäuse erscheinen an Tag E18.5 zyanotisch, leiden unter respiratorischem Stress und sterben innerhalb weniger Minuten. 95 % der GSKIP-defizienten E18.5 Lungen entfalten sich nicht. Körper- und Lungengewicht der Mäuse sind unverändert gegenüber wildtypischen Kontrolltieren. GSKIP-KO-Mäuse, die nach Geburt respiratorischem Stress unterliegen, zeigen gegenüber Kontrollen stark geschädigte Lungenmitochondrien und sowohl ihre Lungen- als auch Lebergewebe besitzen ein auffällig verändertes metabolisches Profil, welches wahrscheinlich für ihren Tod verantwortlich ist. Proteomanalysen identifizierten eine 50 %-ige Abnahme des muskelspezifischen Intermediärfilaments Desmin in GSKIP-KO-Mäusen. Die Verbindung des mitochondrialen Phänotyps mit einer muskelbedingten Fehlfunktion der Atmung würde potentiell die perinatale Letalität GSKIP- defizienter Mäuse erklären. Die perinatale Letalität der Mäuse an Tag E18.5 der Embryonalentwicklung unterstreicht die essentielle Rolle von GSKIP für das extrauterine Leben. Ein 100 % penetranter Phänotyp GSKIP-defizienter Mäuse an Tag E18.5 ist die Ausprägung einer Gaumenspalte. Sowohl GSK3β- als auch Wnt- vermittelte Signalwege liegen als molekulare Mechanismen der Fusion der paarigen Gaumenknochen zugrunde. Im untersuchten Mausmodell war die Verknöcherung der knorpeligen Gaumenknochen in Abwesenheit von GSKIP verzögert. Die erzielten Ergebnisse deuten auf eine koordinierende Rolle von GSKIP in GSK3β- und Wnt-involvierten Signalkaskaden der embryonalen Gaumenknochenbildung und verknöcherung hin. Ein genomweiter microarray und anschließende Validierungsexperimente identifizierten Gene, deren Expression sich aufgrund der Ausschaltung von Gskip verändert: die Expression von Frat2, Rgs1 und Klf2 waren herunterreguliert. Um die Letalität der konditionellen GSKIP-KO-Mäuse zu umgehen, wurden mit Hilfe gewebsspezifischer Promotoren in Kombination mit dem Cre/loxP System zwei adulte, induzierbare GSKIP-KO- Mausmodelle generiert. Da PKA und GSK3β in diversen physiologischen Zusammenhängen mitwirken, u.a. in der Regulation der Kardiomyozytenkontraktion, soll die Ausschaltung von GSKIP in adulten Mäusen und gezielt im adulten Herz weitere Studien zur Aufklärung molekularer Mechanismen ermöglichen.