Untersuchungen von pflanzlichen Latices hinsichtlich ihrer Proteaseaktivität und deren Einfluss auf die Interleukin-6 Sekretion monozytischer Zellen

Abstract

Proteasen spielen sowohl in physiologischen, pathophysiologischen aber auch in industriellen Prozessen eine entscheidende Rolle, so dass die Suche nach neuen Proteasen mit unterschiedlichen Spezifitäten von Bedeutung ist. 311 Pflanzen aus 91 Gattungen aus 11 verschiedenen Familien wurden auf das Vorhandensein proteolytischer Aktivität im Latex untersucht. 75% der untersuchten Pflanzen wurden positiv getestet. Hinsichtlich der Stärke der Aktivität zeichneten sich vor allem die Familien der Euphorbiaceae, Caricaceae und Moraceae durch aus. Die Familie der Asteraceae hingegen fiel durch relativ geringe proteolytische Stärke auf. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass in der Gattung Euphorbia die proteolytische Aktivität konstitutiv ist und über das gesamte Jahr nachzuweisen war. Im Gegensatz dazu zeigten einige Asteraceae und Campanulaceae, dass die gemessene Aktivität vom Entwicklungszustand der Pflanze abhängig ist. Die Untersuchungen deuten auf unterschiedliche Funktionen der Latexproteasen hin. In Euphorbien stellen sie Abwehr-proteine dar und sind in Verbindung mit Diterpenderivaten am „Defence-System“ der Pflanze beteiligt. In den beschriebenen Asteraceae und Campanulaceae spielen sie anscheinend in Entwicklungsprozessen eine Rolle. Das anschließende Screening der Gattung Euphorbia zur Ermittlung des Proteasetyps zeigte, dass Serinproteaseaktivität in allen getesteten Arten feststellbar ist. Dabei reichte die Restaktivität nach Behandlung mit AEBSF von 1-80%. Auch andere Inhibitoren hatten einen Einfluss auch die proteolytische Aktivität. Die Annahme, dass die proteolytische Aktivität in der Gattung Euphorbia ausschließlich auf Serinproteasen beruht, bestätigte sich nicht. Vielmehr hatten in einigen Arten alle getesteten Inhibitoren einen Einfluss auf die Aktivität. Auch Latices, aus denen bisher Serinproteasen isoliert wurden, scheinen Proteasen anderer Typen zu enthalten. Aus dem Latex von Euphorbia mauritanica L. konnte nach Kautschukabtrennung und anschließender DEAE- Ionenaustauschchromatographie und Größenausschlusschromato-graphie eine Proteasefraktion isoliert werden. Die bisher unbekannte Protease Mauritanicain hat eine molekulare Masse von ca. 95 kDa, ein Temperaturoptimum von 55-65°C und ein pH-Optimum von pH 6,5-7,5. Sie zeigt Aktivität über einen pH-Bereich von pH 4,5-12 und ist bis 80°C stabil. Die Protease hat eine gewisse Präferenz, hinter den Aminosäuren Leucin, Lysin und Alanin zu schneiden, aber auch hinter unpolaren Aminosäuren wie Methionin, Valin, Phenylalanin, Isoleucin, Prolin und Glycin. Die Testung mit spezifischen Inhibitoren zeigte, dass es sich um Serinproteaseaktivität handelt. Der Kontakt mit Euphorbienlatices führt zum Teil zu starken Entzündungsreaktionen. Für diese Reaktion werden vor allem Diterpenester verantwortlich gemacht. Es konnte aber auch gezeigt werden, dass Proteasen zu einer vermehrten Sekretion von Il-6 führen. So konnten die Serinprotease Thrombin, die Cysteinprotease Papain und der Diterpenester PMA die Sekretion von Il-6 konzentrationsabhängig und zeitabhängig beeinflussen. Bei der Kombination von PMA mit der jeweiligen Protease konnte eine starke Erhöhung der Il-6 Konzentrationen beobachtetet werden. Ein natürliches Vorkommen von Proteasen und Diterpenestern bieten die Milchsäfte der Gattung Euphorbia. Die Testung von Pflanzenlatices im Zellsystem führte zur Il-6 Sekretion, die von Pflanze zu Pflanze unterschiedlich stimuliert wurde. Eine synergistische Sekretion durch Diterpenester und Proteasen scheint durch den Latex einiger Arten ausgelöst zu werden.

Proteolytic enzymes have important functions in physiological and pathophysiological processes, and are frequently used in industrial processes. The search for new proteases with different specificities is always on. In the present work 311 plants from 91 genera from 11 plant families were examined for the presence of proteolytic activity in the latex. 75% of the studied plants were tested positive for the presence of proteolytic activity. Regarding the strength of the activity the families of Euphorbiaceae, Moraceae, and Caricaceae showed the highest fluorescence values. The families of Asteraceae in contrast, had relatively low proteolytic activity. Furthermore, it was found that in the genus Euphorbia, the proteolytic activity is constitutive, and could be found throughout the year. In contrast, some Asteraceae and Campanulaceae showed that the observed activity is dependent on the developmental state of the plant. The investigations showed the different functions of latex proteases. In Euphorbia, they represent defence proteins and are associated with Diterpene derivatives in the defence system of the plant. In Asteraceae and Campanulaceae they appear to play a role in development processes. The subsequent screening of the genus Euphorbia for determining the type of protease showed that serine protease activity was detected in all tested species. The residual activity after treatment with AEBSF ranged from 1-80%. Other inhibitors had also an influence on the proteolytic activity. The assumption that the proteolytic activity in the genus Euphorbia is based exclusively on serine proteases was not confirmed. In some species all tested inhibitors had an effect on the activity. Latices serine proteases have been isolated from also indicate the presence of other protease types. From the latex of Euphorbia mauritanica L. a protease fraction was isolated after the removal of gum and subsequent DEAE- ion exchange and size exclusion chromatography. The unknown protease Mauritanicain has a molecular mass of approximately 95 kDa, an optimum temperature of 55-65°C and a pH optimum of pH 6.5-7.5. It shows activity over a pH range from pH 4.5 to 12 and is stable up to 80°C. The protease has a preference to cut behind the amino acids leucine, lysine and alanine, but also behind non polar amino acids like methionine, valine, phenylalanine, isoleucine, proline and glycine. The testing with specific inhibitors showed serine protease activity. The contact with latices of genus Euphorbia sometimes leads to severe inflammatory reactions. For this reaction primarily diterpene esters are responsible. It could also be shown that proteases lead to an increased secretion of the proinflammatory cytokine Il-6 in acute inflammation in differentiated U-937 cells. The serine protease thrombin, the cysteine protease papain and the diterpene ester PMA affect the secretion of Il-6 in a concentration and time dependent manner. With the combination of PMA with the respective protease a strong increase in Il-6 concentrations was observed. Proteases and diterpene esters naturally occure in the latices of the genus Euphorbia. The testing of Euphorbia-latices resulted in individual levels of Il-6 secretion in the cell system. A synergistic secretion by diterpene esters and proteases is propable to be induced by the latex of some species.