Entwicklung und Machbarkeitsnachweis eines Luminex-basierten, QuantiGene HPV-E7 mRNA genotypisierenden Nachweisverfahrens

Abstract

Die humanen Papillomviren (HPV) zählen zu den am häufigsten sexuell übertragenen Infektionen. Eine persistierende Infektion mit einem HP-Virus vom high risk (hr)-Typ gilt heute als Hauptursache für die Entstehung des Zervixkarzinoms. Ein HPV-DNA-Test ist hoch sensitiv (>95%), erfasst allerdings auch die transient verlaufenden HPV-Infektionen, die folgenlos ausheilen (ca. 90%). Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit der auf dem direkten Nachweis von HPV-E7 mRNA basierende QG-HPV Version 1 Nachweistest konzipiert und auf seine grundlegende Funktionalität hin überprüft. Die HPV-E7 mRNA Expression ist während der Progression von Epithelzellen der Zervix zu hochgradig dysplastischen und maligne entarteten Zellen stark erhöht. Der Nachweistest verbindet die xMAP-Technologie (Luminex) mit der bDNA-Signalamplifikationsmethode und ist ausgestattet mit insgesamt 10 verschiedenen Gensonden zum parallelen, typenspezifischen Nachweis von 6 hr-HPV-Typen (16, 18, 31, 45, 59 und 68), einem low risk-HPV (6), zwei zellulären Markern (Actin-β, HPRT1) und einem Marker für HPV infizierte Zellen (CDKN2A syn. P16INK4a). Als Probenmaterial wurden hauptsächlich kultivierte und definierte Zervixkarzinomzelllinien (HeLa, CaSki, MRHI-215, ME180, Erin59, C33a und NIH 3T3) und eine geringe Anzahl authentischer Patientenproben verwendet. Alle Proben wurden mit dem Multiplex Genotyping HPV Test von Schmitt et al. gegengetestet (1). Der QG-HPV-Test detektiert erfolgreich spezifisch die E7 mRNA der HPV-Typen 16, 18, 45, 59, und 68 in Korrelation zur eingesetzten Gesamtzellzahl (Actin-ß, HPRT-) und den hr-HPV infizierten Zellen (p16). Für diese Analyten wird mit Proben aus kultiviertem Zervixkarzinomzellen eine Sensitivität von 100% erreicht. Eine Kreuzreaktivität wurde nicht beobachtet. Die Intra-Assay Variation lag bei allen auf Actin-β normalisierten Analyten unter 10%, die Inter-Assay Variation mit Ausnahme von HPV45 (16,1%) unter 15%. Die Interobserver Varianz für HPV16 lag bei 6,1%. Bei ca. 33 HPV-infizierten Zellen kann noch eine Quanti- und Qualifizierung der gemessenen Probe erfolgen, mit Ausnahme der Sonden für HPV45 und 59 sogar bei 11 Zellen. Valide Ergebnisse können durch das Assay in einem Bereich zwischen ca. 33 - 1.000 HPV-positiven Zellen erreicht werden. Die Detektion war auch in einem ca. 8fach höheren Hintergrund HPV-negativer Zellen und nach 28 Tagen in PBS vergleichbar möglich. Das Transportmedium PreservCyt (Hologic Inc.) ist kompatibel und bietet die optimale Konservierung des Probenmaterials. Bei einer ersten Messung von Patientenproben wurde in den eingeschlossenen Proben (n = 15) 100% aller detektierbaren Infektionen erkannt [HPV 16 (11/11), HPV 18 (3/3) und HPV 45 (3/3)]. Lediglich für HPV59 (1/16), HPV6 (3/16) und HPV45 (11/13)wurden falsch-positive Ergebnisse gemessen, wobei für HPV6 und HPV45 auch schon zuvor bei kultivierten Zellen teils hohe, unspezifische Hintergründe gemessen wurden. Eine abschließende Beurteilung dieser beiden Sonden steht somit noch aus. Das QG-HPV V1 Assay beweist somit grundsätzlich seine technische Funktionalität und ausreichend Potential für eine ausführliche klinische Testung.

The human papillomaviruses (HPV) is one of the most common sexually transmitted diseases. A persistent infection with a high risk (hr) HPV-type is the primary cause for the emergence of cervical cancer. A HPV-DNA-Test is highly sensitive (>95%) but also catches the transient HPVinfections that heal without ramifications (~90%). Therefor the QG-HPV Version 1 detection assay was developed and checked for its based functionality. The test is based on the detection of HPVE7 mRNA, which is upregulated in highly dysplastic and malignant epithelial cells of the cervix. The test connects the xMAP-technology with the bDNA-signal amplification method and is equipped with a total of 10 different gene probes for the parallel, type-specific detection of six hr- HPV-types (16, 18, 31, 45, 59 and 68), a single low risk-HPV (6), two cellular markers (Actin-β, HPRT1) and a single marker for HPV infected cells (CDKN2A syn. P16INK4a). For the measurements mainly cultivated and defined cervical cancer cell lines were used (HeLa, CaSki, MRHI-215, ME180, Erin59, C33a and NIH 3T3) plus a small number of authentic patient samples. All samples were crosschecked with the multiplex genotyping HPV Test from Schmitt et al (1). The QG-HPV test successfully detects specific E7 mRNA HPV-types 16, 18, 45, 59 and 68, in correlation to the used sum of cells (Actin-β, HPRT-) and the hr-HPV infected cells (p16). Measured with samples from cultivated cervical cancer cells, the sensitivity for this analyses reached 100% and a cross reactivity couldn’t be observed. The intra-assay variation was below 10% for probes normalized to Actin-β. The inter assay variation was below 15% with the exception of the HPV45 (16.1%). The interobserver variation for HPV16 measured 6.1%. At least 33 (excluded the probes for HPV45 and 59 even 11) HPV-infected cells achieved a positive result above the calculated limit for quanti- and qualification. The detection range is between 33-1.000 HPV-positive cells. Signals could even be detected in a 8 times higher background of HPVnegative cells or after 28 days in PBS. The PreservCyt solution (Hologic Inc.) can be used with the QG-HPV V1 assay for the optimal conservation of the sample materials. On the first measuring of patient samples 100% of all included (n=15) and detectable infections [HPV16 (11/11), HPV 18 (3/3) and HPV 45 (3/3] could be identified. Only HPV59 (1/16), HPV6 (3/16), and HPV45 (11/13) showed false-positive results, of which HPV6 and HPV45 showed high, unspecific backgrounds in cultured cells. A final assessment of these two probes is still pending. The QG-HPV V1 assay therefore proves its fundamentally technical functionality and has enough potential for an expanded clinical test.