Impact of CD362+ -selected mesenchymal stromal cells on left ventricular function in type 2 diabetic db/db mice

Abstract

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are an attractive cell-type for cell therapy, given their immunomodulatory, anti-fibrotic, and endothelial-protective features. The EU Committee for Advanced Therapies highlighted the need for strategies of selecting and purifying MSCs, whereupon the cell-surface sulfated proteoglycan CD362 has been identified as a new candidate. The aim of the present study was to compare the impact of intravenous (i.v.) application of wildtype (WT), CD362-- and CD362+-selected MSCs on left ventricular (LV) function in type 2 diabetic mice and to investigate the underlying mechanisms. For this purpose, 106 WT-MSC, CD362-, or CD362+ cells or PBS were i.v. injected into 20-week-old diabetic BKS. Cg-m+/+Leprdb/BomTac db/db mice. Non-diabetic db+/db mice injected with PBS served as controls. Mice were hemodynamically characterized and sacrificed four weeks after cell or PBS application. Spleens were collected for flow cytometry and LVs for immunohistochemistry, molecular biology, and imaging mass spectrometry. I.v. injection of WT-MSC and CD362- cells, but not of CD362+ cells improved LV function in db/db mice as indicated by an improvement of the contractility parameters dP/dtmax, dP/dtmin and/or Tau (p<0.05). With respect to immune modulation, only CD362+ cells raised the percentage of splenic regulatory T cells (Tregs) by 1.3-fold (p<0.001), whereas WT-MSC, CD362-, and CD362+ cells all decreased the percentage of splenic apoptotic Tregs in db/db mice (p<0.001 each versus db/db mice). Additionally, the number of cardiac CD3+ cells was 1.5-fold (p<0.05), 1.8-fold (p<0.01), and 1.7-fold (p<0.01) reduced in db/db mice injected with WT-MSC, CD362-, and CD362+, respectively, compared to db/db mice. Interestingly, application of WT-MSC, CD362-, and CD362+ cells led to a 1.6-fold (p<0.05), 1.8-fold (p<0.01), and 1.6-fold (p<0.05) decreased number of cardiac CD68+ cells. A hypothesis-free proteome analysis via imaging mass spectrometry further indicated a lower expression of the titin isoform N2B in db/db versus db+/db mice, which could be overcome after i.v. application of all investigated cells. In agreement with the LV function, total titin phosphorylation was 1.8-fold (p<0.01) downregulated in db/db versus db+/db mice, which was only induced after application of WT-MSC (1.6-fold; p<0.05) and CD362- (1.5-fold; p<0.05). In parallel, protein kinase G activity dropped by 1.5-fold (p<0.05) in db/db versus non-diabetic db+/db mice and was normalized to control levels in WT-MSC db/db and CD362- db/db mice. In conclusion, WT-MSC and CD362- cells, but not CD362+ cells improve LV function in diabetic db/db mice via titin regulation.

Angesichts ihrer immunmodulatorischen, anti-fibrotischen und endothel-protektiven Eigenschaften, stellen mesenchymale stromale Zellen (MSZ) einen vielversprechenden Zelltyp für zell-therapeutische Interventionen dar. Das EU Komitee für zukunftsweisende Therapien unterstrich die Notwendigkeit von Strategien zur Selektion und Aufreinigung von MSZ, woraufhin das sulfatierte Proteoglykan CD362, welches auf der Zelloberfläche der MSZ zu finden ist, als neuer Kandidat identifiziert wurde. Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss von intravenös (i.v.) applizierten Wildtyp (WT), CD362-- und CD362+-selektieren MSZ auf die linksventrikuläre (LV) Funktion in Typ-2 diabetischen Mäusen zu vergleichen und die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hierfür wurden 106 WT-MSZ, CD362-- bzw. CD362+-Zellen oder PBS i.v. in 20 Wochen alte diabetische BKS.Cg-m+/+Leprdb/BomTac db/db-Mäuse injiziert. Nicht diabetische db+/db-Mäuse, welchen PBS appliziert wurde, dienten als Kontrolle. Vier Wochen nach Applikation erfolgte die hämodynamische Charakterisierung und anschließende Euthanasie der Tiere. Für durchflusszytometrische Analysen wurde die Milz entnommen, sowie der LV für Immunhistologie, Molekularbiologie und bildgebende Massenspektrometrie. Die i.v. Injektion von WT-MSZ und CD362--Zellen, aber nicht von CD362+-Zellen, verbesserte die LV Funktion in den db/db-Mäuse, was sich in einer Verbesserung der Kontraktilitätsparameter dP/dtmax, dP/dtmin und/oder Tau zeigte (p <0.05). Bezüglich der Immunmodulation, erhöhte nur die Gabe der CD362+-Zellen den prozentualen Anteil an regulatorischen T Zellen (Tregs) in der Milz um das 1.3-fache (p<0.001), wohingegen WT-MSZ, CD362-- und CD362+-Zellen den Anteil an apoptotischen Tregs in der Milz verringerten (p<0.001 jeder Zelltyp gegenüber db/db-Mäuse). Verglichen mit den PBS-behandelten db/db-Mäusen war zusätzlich die Zahl an kardialen CD3+-Zellen um das 1.5-fache (p<0.05), 1.8-fache (p<0.01) und 1.7-fache (p<0.01) nach Injektion von WT-MSZ, CD362-- bzw. CD362+-Zellen reduziert. Interessanterweise führte die Applikation von WT-MSZ, CD362-- bzw. CD362+-Zellen auch zu einer 1.6-fach (p<0.05), 1.8-fach (p<0.01) bzw. 1.6-fach (p<0.05) verringerten Zahl an kardialen CD68+-Zellen. Die hypothesenfreie Proteomanalyse mittels bildgebender Massenspektrometrie zeigte darüber hinaus eine verringerte Expression der Titin-Isoform N2B in den db/db-Mäusen gegenüber den db+/db-Mäusen, welche durch i.v. Anwendung aller untersuchten Zellen verbessert werden konnte. In Übereinstimmung mit der LV Funktion war die totale Titin-Phosphylierung in den db/db-Mäusen, im Vergleich zu den db+/db-Mäusen, um das 1.8-fache (p<0.01) herunterreguliert, welche nur durch die Applikation von WT-MSZ (1.6-fach; p<0.05) und CD362--Zellen (1.5-fach; p<0.05) induziert wurde. Parallel dazu, fiel die Proteinkinase G-Aktivität um das 1.5-fache (p<0.05) in den db/db-Mäusen gegenüber den nicht-diabetische db+/db-Mäusen und war in WT-MSZ und CD362- db/db-Mäusen wieder normalisiert. Abschließend kann gesagt werden, dass WT-MSZ und CD362--Zellen, aber nicht die CD362+-Zellen, die LV Funktion durch eine Regulation von Titin verbessern.